Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo
Summary
El diseño y desarrollo de un ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Además, una aplicación colorimétrico smart-dispositivo (app) fue validado y se estableció el almacenamiento a largo plazo del ensayo para uso en el campo.
Abstract
El diseño y desarrollo de una nanopartícula de oro-aptámero (AuNP) ensayo colorimétrico para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Los ensayos de color basadas objetivo AUNP selectiva se han desarrollado en el laboratorio de prueba de concepto controladas. Sin embargo, estos sistemas no han sido ejercida a un punto de fallo para determinar su uso práctico más allá de la configuración de laboratorio. Este trabajo describe un enfoque genérico para diseñar, desarrollar y solucionar problemas de un ensayo colorimétrico aptámero-AuNP para las pequeñas moléculas y analitos utilizando el ensayo para los ajustes en-el-campo. El ensayo es una ventaja, ya aptámeros adsorbidos pasivar las superficies de las nanopartículas y proporcionan un medio para reducir y eliminar las respuestas positivas falsas a analitos no objetivo. La transición de este sistema para usos prácticos necesario definir no sólo el período de validez del ensayo aptámero-AuNP, pero el establecimiento de métodos y procedimientos para la ampliación de la capaci almacenamiento a largo plazodades. Además, una de las preocupaciones reconocidas con lectura colorimétrica es la carga que para los analistas identificar con precisión los cambios a menudo sutiles en el color. Para disminuir la responsabilidad de los analistas en el campo, un protocolo de análisis de color fue diseñado para realizar las tareas de identificación de color sin la necesidad de llevar a cabo esta tarea en el equipo de calidad de laboratorio. Se describe el método para crear y probar el protocolo de análisis de datos. Sin embargo, para entender e influir en el diseño de los ensayos de aptámeros adsorbidos, las interacciones asociadas con el aptámero, objetivo y AuNPs requieren más estudios. El conocimiento adquirido podría conducir a la adaptación de los aptámeros para una funcionalidad mejorada.
Introduction
Colorimetría es una de las técnicas más antiguos utilizados en química analítica. Para esta técnica, una determinación cualitativa o cuantitativa del analito se realiza basándose en la producción de un compuesto coloreado 1. Por lo general, los ensayos de color utilizan reactivos que experimentan un cambio de color en presencia de la especie de analito, lo que se traduce en un cambio de color observable o detectable en el espectro de luz visible. Colorimetría se ha utilizado en la detección de blancos que van de átomos, iones y moléculas pequeñas a moléculas biológicas complejas tales como ácidos desoxirribonucleico (ADN), péptidos y proteínas 2-4. Para las últimas dos décadas, los nanomateriales han revolucionado el campo de los ensayos de detección, en particular con los ensayos basados en color 5-6. La combinación de las propiedades químicas y físicas únicas de los nanomateriales con un elemento de reconocimiento selectivo de destino, tales como los anticuerpos, aptámeros de oligonucleótidos o aptámeros de péptidos, ha llevado al resurgimiento in el diseño y desarrollo de ensayos de detección colorimétricos 7.
Las nanopartículas metálicas tienen un demostrado la propiedad de cambio de color dependiente del tamaño, que ha sido explotado en el diseño de numerosos ensayos colorimétricos. Las nanopartículas de oro (AuNPs) son de particular interés debido a un cambio de color de rojo a azul característico, cuando se induce la solución dispersada de partículas de agregar 8, típicamente a través de la adición precisa de sal. La capacidad de controlar la transición de los dispersos (rojo) a los estados (azul) agregados ha llevado a la creación de sensores colorimétricos para iónico, pequeña molecular, péptido, proteína, y objetivos celulares 2-4,9. Muchos de estos sensores emplean aptámeros como el motivo de reconocimiento de diana.
Los aptámeros son moléculas de ADN o ácido ribonucleico (ARN) seleccionado de un grupo aleatorio de 10 12 -10 15 secuencias diferentes 10-11. El proceso de selección de destino identifica reelementos de la cognición con afinidades de unión en el régimen de baja nanomolar, y la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el proceso más comúnmente conocida 12-13. Ventajas de aptámeros base de oligonucleótidos para aplicaciones de detección incluyen la facilidad de síntesis, modificación química controlable, y la estabilidad química 14-15.
Un enfoque para la creación de un ensayo colorimétrico combina los nanomateriales con elementos de reconocimiento, consiste en la combinación de estas dos especies a través de la adsorción física de moléculas de ADN-aptámero a superficies AUNP. A través de unión a la diana-aptámero, el aptámero experimenta un cambio estructural 16 a 18, que altera la interacción del aptámero con la superficie AuNP, lo que conduce a una respuesta de color de rojo a azul inducible 19 con la adición de sal. Esta característica sorprendente de AuNPs proporciona un mecanismo de respuesta colorimétrica observable para dispositivos basados en aptámeros que se pueden utilizar a Defirmar ensayos colorimétricos para diferentes analitos.
Los ensayos de color diseñados utilizando no covalentes, aptámeros de ADN físicamente adsorbidos sobre superficies AUNP tienen el estigma de ser una plataforma de sensores débil debido a problemas con la solidez, una propensión a la insuficiencia fuera de los entornos controlados de laboratorio, y la falta de información disponible para el uso en la práctica ajustes. Sin embargo, el ensayo colorimétrico basado aptámero-AuNP era de interés debido a la simplicidad de operación y respuesta de color observable. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para el diseño, desarrollo, operación, reducción de la superficie de respuesta relacionada con falso positivo, y el almacenamiento a largo plazo de ADN-AUNP ensayos colorimétricos basados utilizando cocaína como representante del analito. Por otra parte, hemos propuesto este adsorbido aptámero enfoque de ensayo (Figura 1) de representar una ventaja debido a la simplicidad y facilidad de uso que resultó en menos pasos que el enfoque convencional para estos aptámero-AuNP culoays. Para este ensayo, el aptámero se añadió primero a las AuNPs, que se les permitió a adsorberse a la superficie por un período prolongado de tiempo. Una ventaja adicional de este enfoque fue la reducción de la respuesta a moléculas de analito no objetivo relacionados con las interacciones de superficie AUNP. Sin embargo, la reducción en la respuesta falso positivo era a expensas de la sensibilidad del ensayo. Por lo tanto es necesario un equilibrio entre la protección de la superficie y la accesibilidad analito para mantener la función del análisis. Por otra parte, uno de los principales defectos de analizar los ensayos de color a través de medios distintos de la instrumentación es que los resultados son a menudo subjetiva y abierta a la interpretación del analista a analista, sobre todo cuando se trata de diferenciar diferencias sutiles en el color. Por el contrario, hay una serie de problemas con la fabricación de instrumentación de laboratorio basado utilizable fuera del laboratorio, tales como la disponibilidad de potencia, funcionalidad y portabilidad, etc. En este trabajo, un protocolo de análisis de color fue desarrollado para more portabilidad y para eliminar algunas de las conjeturas comúnmente asociada con la interpretación de ensayo basado en el color 20-21. En comparación con los enfoques anteriores, este esfuerzo se esforzó para empujar estos ensayos a sus límites para aplicaciones más allá de los ambientes de laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la última década, ensayos colorimétricos basados en nanopartículas se han desarrollado para la detección de blancos incluyen pequeñas moléculas, ADN, proteínas y células de 2-4. Los ensayos que utilizan DNA aptámeros con nanopartículas han ido ganando interés. Típicamente, estos ensayos colorimétricos se llevan a cabo mezclando el ADN de aptámero con moléculas de analito seguido de la adición a AuNPs 9-10. Sin embargo, estos ensayos se han utilizado en las manifestaci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
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