インフィールドアプリケーションの設計およびアプタマー金ナノ粒子基づく比色アッセイの開発
Summary
インフィールドの用途のための小分子の検出のためのアプタマー – 金ナノ粒子の比色アッセイの設計および開発を検討しました。さらに、スマートデバイス測色アプリケーション（アプリ）が検証された、アッセイの長期保存は、フィールドでの使用のために設立されました。
Abstract
インフィールドの用途のための小分子の検出のためのアプタマー – 金ナノ粒子（AuNP）比色アッセイの設計および開発を検討しました。ターゲット選択AuNPベースのカラーアッセイが制御さ、概念実証実験室の設定で開発されてきました。しかし、これらの方式は、実験室の設定を超えて、その実用化を決定するために、障害発生時点に発揮されていません。この作品は、小分子検体とインフィールドの設定のためのアッセイを使用するためのアプタマー – AuNP比色アッセイを設計、開発、およびトラブルシューティングするための一般的なアプローチについて説明します。吸着されたアプタマーは、ナノ粒子表面を不動態化し、低減し、非標的分析物に偽陽性反応を排除するための手段を提供するので、アッセイが有利です。実用的な用途にこのシステムを移行することはアプタマー-AuNPアッセイの貯蔵寿命だけでなく、を定義するが、長期保存capabilを拡張するための方法および手順を確立する必要ities。また、比色読み取りと認識懸念事項の一つは、正確に色で頻繁に微妙な変化を識別するために、アナリストの負担です。フィールドのアナリスト上の責任を軽減するには、色分析プロトコルは、実験室グレードの機器でこのタスクを実行するための必要なく、色識別職務を行うために設計されました。データ分析プロトコルを作成し、テストするための方法が記載されています。しかし、理解し、吸着したアプタマーアッセイの設計に影響を与えるために、相互作用は、アプタマー、ターゲットに関連付けられている、とAuNPsは、さらなる研究が必要です。得られた知識は、機能向上のためのアプタマーを仕立てにつながる可能性があります。
Introduction
測色は、分析化学で使用される最も古い技術の一つです。この技術については、検体の定性的または定量的決意着色化合物1の製造に基づいて行われます。典型的には、色アッセイは、可視光スペクトルにおいて観察または検出可能な色の変化をもたらす検体種の存在下で色ずれが発生する試薬を使用します。測色は、デオキシリボ核酸（DNA）、ペプチド、およびタンパク質2-4のような複雑な生物学的分子の原子、イオン、および小分子の範囲の標的の検出に使用されてきました。過去20年間では、ナノ材料は、特にカラー基づくアッセイ5-6と、検出アッセイの分野に革命をもたらしてきました。このような抗体、オリゴヌクレオチドアプタマーまたはペプチドアプタマーとして、標的選択的認識要素とナノ材料の固有の化学的および物理的特性を組み合わせ、復活につながっている私比色検出アッセイ7の設計と開発をn個。
金属ナノ粒子は、多数の比色アッセイの設計に利用されている実証サイズ依存色変化特性を有します。金ナノ粒子（AuNPs）が原因で、粒子の分散液は、通常、塩の正確な添加して、8を集約するように誘導された特徴的な赤から青へのカラーシフトに特に重要です。凝集（青）の状態に分散（赤）からの移行を制御する能力は、イオン、小分子、ペプチド、タンパク質、および細胞標的2-4,9ための比色センサーの作成 につながっています。これらのセンサの多くは、標的認識モチーフとしてアプタマーを使用します。
アプタマーは、10 12 -10 15の異なる配列10-11のランダムプールから選択されたDNA又はリボ核酸（RNA）分子です。選択プロセスは、ターゲットの再を識別する認知低ナノモル領域における結合親和性を持つ要素、および指数関数的濃縮（SELEX） によって、リガンドの系統的進化は、最も一般的に知られているプロセス12-13です。アプリケーションを検出するためのオリゴヌクレオチドベースのアプタマーの利点は、合成の容易さ、制御可能な化学的修飾、および化学的安定性14-15が含まれます。
比色アッセイを作成するための1つのアプローチは、認識要素とナノ材料を組み合わせたAuNP表面へのDNAアプタマー分子の物理吸着を介してこれらの二つの種を組み合わせで構成されています。標的アプタマーの結合を介して、アプタマーは、塩の添加により誘導可能な赤から青への色応答19につながるAuNP表面とアプタマーとの相互作用を変化させる構造変化16-18を経験します 。 AuNPsのこの驚くべき特徴は、解除するのに使用することができるアプタマーベースのデバイスのための観察、比色応答機構を提供します異なる分析物のための比色アッセイに署名。
AuNP表面上の非共有結合、物理吸着DNAアプタマーを用いて設計されたカラーアッセイが原因で堅牢性、制御された実験室の設定の外の故障の傾向、および実用的に使用するための利用可能な情報の不足の問題に弱いセンサープラットフォームであることの汚名を持っています設定。しかし、アプタマーAuNP基づく比色アッセイがあるため、操作や観察可能な色反応を簡単に興味深かったです。この研究の目的は、代表的な検体としてコカインを使用したDNA-AuNP基づく比色アッセイの設計、開発、運用面の減少に関連する偽陽性反応、および長期保存のためのプロトコルを提供することです。さらに、我々は、これらのアプタマー-AuNPのお尻のための従来のアプローチよりも少ないステップで得られた使いやすさと使いやすさに有利で あるとして、この吸着されたアプタマーアッセイ法（ 図1）を提案しましたAYS。このアッセイでは、アプタマーは、最初に長期間の表面に吸着させたAuNPsに添加しました。このアプローチのさらなる利点は、AuNP表面相互作用に関連する非標的分析物分子に対する応答の減少でした。しかし、偽陽性反応の減少は、アッセイ感度を犠牲にしました。したがって、表面保護と検体アクセス性とのバランスが適切なアッセイの機能を維持するために必要です。また、経由色アッセイを分析する主要な欠陥が計測器を用いた場合よりも、他の意味色の微妙な違いを区別しようとしている場合は特に結果は、しばしば主観的でからアナリスト・ツー・アナリストの解釈に開いていることです。逆に、本 研究では電力等の利用可能性、携帯性と実用性、として、ラボ外で使用可能な実験室ベースのインスツルメンテーションを行うことで多くの問題があり、色解析プロトコルは、MORのために開発されました電子移植性と一般的に色ベースのアッセイの解釈20-21に関連した当て推量のいくつかを排除します。従来のアプローチと比較すると、この努力は、実験室の設定を超えたアプリケーションのための彼らの限界にこれらのアッセイをプッシュする努力しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去10年間、ナノ粒子ベースの比色アッセイは、小分子、DNA、タンパク質、細胞2-4を含む標的の検出のために開発されています。ナノ粒子とDNA-アプタマーを使用するアッセイは、関心を集めています。典型的に、これらの比色アッセイはAuNPs 9-10に加え、続いて、分析物分子と、DNAアプタマーを混合することによって行われます。しかし、これらのアッセイは、制御された実?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
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