Summary
Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.
Abstract
Förster rezonans enerji transferi son gelişmeler (FRET) sensörleri iyonların ve amino asitler gibi çeşitli küçük moleküller tespit etmek kullanımını sağlamıştır. Ancak, FRET sensörlerinin doğuştan zayıf sinyal yoğunluğu çeşitli alanlarda uygulamalarını engeller ve pahalı, high-end kullanılması gerekli Fluorometreler yapan önemli bir sorundur. Daha önce, özellikle yüksek algılama hassasiyetini elde etmek için iki emisyon dalga boyu bantları (530 ve 480 nm) oranını ölçebilen bir maliyet-etkin, yüksek performanslı FRET analizörü inşa. 55 ° C - Daha yakın zamanda, bakteriyel periplazmik bağlayıcı proteinleri ile FRET sensörler 50 kritik sıcaklık aralığında en yüksek hassasiyete sahip ligandlar tespit keşfedilmiştir. Bu rapor, bir ısı özgü FRET sensörü ile portatif FRET analizörü kullanılarak ticari olarak temin edilebilen içecek numuneleri şeker içeriği değerlendirmek için bir protokol açıklamaktadır. Bizim sonuçlar ek ön ısıtma gösterdiFRET sensörünün süreci önemli ölçüde şeker içeriği daha doğru ölçüm sağlamak için, FRET oranı sinyalini artırır. ısmarlama FRET analizörü ve sensör başarıyla ticari içecek üç tip şeker içeriği ölçmek için uygulanmıştır. Biz high-end ekipman mevcut olmadığı durumlarda ekipman daha fazla boyut küçültme ve performans geliştirme ortamlarında el analiz kullanımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.
Introduction
Förster rezonans enerji transferi (FRET), yaygın olarak, şekerler, kalsiyum iyonları, ve amino asitler 1-4 küçük moleküllerin tespit biyometrik sensör olarak kullanılmıştır. FRET biyosensörler floresan proteinleri, mavi floresan proteinleri (Çağrıları) ve periplazmik-bağlayıcı proteinlere (PBP) her iki ucuna kaynaştırılır san bir floresan proteinleri (YFPs), ihtiva etmektedir. Şekerler daha sonra PBP her iki ucunda iki floresan protein mesafesi ve geçiş dipol yönünü değiştirme sensörüne yapısal değişikliklere neden FRET sensörü ortasında bulunan PBP bağlanır. Bu değişiklik, EYFP (530 nm) ve ECFP (480 nm) emisyon dalga boyları oranını ölçerek şeker içeriğinin nicel analiz edilmesini sağlar. Yüksek hassasiyet, seçicilik, gerçek zamanlı izleme kapasitesi ve FRET biyosensörlerin hızlı tepki süresi sayesinde, bu sensörler yaygın çevresel, endüstriyel ve tıbbi uygulamalarda 5 kullanılmaktadır. Ayrıca, ratiomSensör konsantrasyonu kolaylıkla kontrol edilebilir ve eşiğe her zaman mevcut olamaz kompleks biyolojik örneklerinde bileşenleri ölçmek için kullanılabilir gibi FRET biyosensörler kullanılarak Etric ölçümü, önemli pratik avantajları vardır.
nicel görselleştirme için FRET tabanlı sensörlerin bu avantajlara rağmen, floresan proteinleri eksik alan hareket transferi ile küçük yapısal değişiklikler doğal olarak zayıf sinyal yoğunluğu üretir. Bu zayıf sinyal in vitro ya da in vivo analiz 6'da FRET bazlı sensörler uygulanmasını sınırlar. Sonuç olarak, çoğu biyosensörler pahalı ve son derece hassas ekipmanların kullanılmasını gerektirir FRET. Daha önce, mevcut flüoresan analiz 7 benzer yetenekleri ile ucuz ve taşınabilir bir FRET analizörü geliştirdi. Bu cihaz, ucuz 405-nm bant ultraviyole ışık yayan diyot (LED) olarak th uyarma neden ışık kaynağı olarak kullanıldıe floresan sinyali, pahalı bir lamba veya lazer değiştirilmesi. analizörü algılama sistemi verimli bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle üzerine dissipating floresan sinyali odaklanır. 55 ° C belirgin oranlı metrik FRET sinyalini 8 büyütmek olabilir - daha yeni bir çalışmada, 50 tespit sıcaklığının optimizasyonu olduğunu göstermiştir. Bu sıcaklık-spesifik sinyal geliştirme, ısmarlama FRET analizörü ile birlikte hızlı ve yüksek hassasiyet ile daha genel tanısal uygulamalarda FRET sensörlerinin kullanılmasını sağlar.
Bu protokol, biz ticari olarak temin edilebilen içeceklerin şeker içeriğinin miktarının optimal FRET sıcaklık koşulları altında FRET analizörü genel uygulanabilirliği gösterdi. Bu protokol FRET cihaz operasyonun ayrıntıları yanı sıra, sensörlü ve numune hazırlama kısa bir açıklamasını sağlar. Bu raporun taşınabilir potansiyel uygulanmasını teşvik edeceğini tahminküçük ölçekli laboratuvar ortamlarında analiz ve FRET tabanlı biyosensörler ile ucuz bünyesinde tanı cihazı daha da geliştirilmesi için bir temel oluşturacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biyosensör 1. Hazırlık
- Daha önce kurulan protokol 2 aşağıdaki ile CFP-MBP-YFP His6 - plazmid pET21a (+) Construct.
- Bir Escherichia coli DE3 soyunun tek bir koloni ile Luria etsuyu (LB) 5 ml inoküle ve çalkalanarak 16 saat 37 ° C'de inkübe edin.
- Aktarım 100 mi LB ihtiva eden ve 600 nm'de (OD600) 'deki optik yoğunluk 0.5 (yaklaşık 3 saat) ulaşana kadar bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C'de inkübe 500 ml'lik bir şişeye O / N kültürünün 1 mi.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1000 x g'de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj her bir tüp içinde hızlı bir şekilde pelletini.
- Hafifçe çözeltisi (elektro hücreleri) kadar dönen% 10 (h / h) gliserol ile buz soğukluğunda DW 50 ul pelletini bir OD ulaşır 600
- Bir elektroporasyon cihazı ve elektroporasyona bir buz soğukluğunda elektroporasyon küveti içinde CFP-MBP-YFP His6 - ve plazmid pET21a (+), 10 ng (OD 100 600 hücreleri 50 ul) elektro uyumlu hücre karışımı yerleştirin karışım (18 kV / cm, 25 uF'de).
- Hızlı bir şekilde yumuşak bir 15 ml lik yuvarlak dipli tüp çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de geri ardından yavaşça hücreler, küvete 1 ml SOC ortamı ilave edin ve tekrar süspansiyon.
- 100 ug / ml ampisilin içeren LB plakasına hücrelerinin yayılmasını ve 12 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- bir döngü kullanarak tek bir koloni izole etmek ve LB 12 saat süre ile bir çalkalama 37 ° C'de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 10 ml koloni inoküle.
- 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 500 ml tohum kültürü 5 ml ilave edilir ve 37 ° C sıcaklıkta çalkalanarak kuluçka makinesi içinde kültür inkübe edin.
- 0.5 mM izopropil β-D-tiyogalaktozid (IPTG) OD 600 ulaşır ekleme0.5 ile 24 saat boyunca 37 ° C'de çalkalama inkübatöründe kültür inkübe edin.
- Santrifüj 20 dakika (4 ° C) ve yavaşça süpernatant kaldırmak için 4.500 x g'de hücreleri.
- 5 ml bağlama tamponu (20 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM PMSF, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde pelletini.
- Her soğutma 10 sn patlama sonrasında 200-300 W altı 10 sn patlamaları ile buz üzerinde hücreleri ses dalgalarına maruz.
- 10.000 × lizat santrifüj 4 ° C'de 30 dakika boyunca g hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni bir toplama tüpüne süpernatant (çözünür protein) aktarın.
- Ni-NTA afinite sütunu (5 ml hacim) üzerine FRET sensör proteinlerinin eğilim saflaştırılmasına yük temizlenmiş hücre lizatının 4 mi elde etmek ve hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) 18 kullanarak bir kromatografi deneme yapmak.
- Yıkama tamponu, beş kolon hacmi ile bir kez kolon yıkaması I (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 10 mM imidazol, pH 7.0).
- yıkama tamponu II beş kolon hacmi (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 20 mM imidazol, pH 7.0) ile yıkama adımı tekrar edin.
- Elüsyon tamponu, beş kolon hacmi (50 mM fosfat tamponu, 300 mM sodyum klorür, 500 mM imidazol, pH 7.0) ile sensör proteinini ayrıştırmak.
- konsantre edilen örnek desalt için 3000 x g'de 10 dakika boyunca numune ve santrifüj kadar 20 ml konsantratör (10,000 MW zar boyutu) doldurun. % 0.8 fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yoğunlaştırıcı doldurun. İlk örnek, 20 ml ile konsantratör doldurulması ve daha sonra PBS ile tekrar doldurulması, iki kez yineleyin.
- Konsantre ve de-tuzlu sensör protein kurtarmak ve -80 ° C'de saklayın.
FRET Analyzer kullanarak Şeker İçeriği 2. Ölçüm
NOT: FRET analizörü yapım ayrıntıları daha önceki çalışmalarında 7'de tarif edildi.
- % 0.8 PBS 0.2 içeren bir algılama çözüm hazırlayınSensör proteinlerinin uM.
- FRET analizörü açın. Optimal sıcaklığı ayarlamak için 2 sn "UP" butonuna basın. "UP" ve "DOWN" tuşlarını kullanarak 53 ° C'ye sıcaklığı ayarlamak ve "SET" düğmesine basın.
- Kalibrasyon, basın ve 2 saniye aynı anda "UP" ve "DOWN" tuşlarını tutun. LED panelinde "CALIB" ve "SET" tuşuna basınız emin olun.
- Sadece PBS analizörü bir küvet tutucu içine tampon ve "SET" tuşuna basınız içeren 12.5 × 12.5 × 45 mm (uzunluk x genişlik x yükseklik) dikdörtgen paralelkenar damar (küvet) yerleştirin.
- bir şeker (maltoz / sakaroz) olmadan sadece algılama solüsyonu (2.1 bakınız) içeren küveti değiştirin ve taban çizgisini kalibre etmek için "SET" tuşuna basınız.
- 10 mM şeker ile tespit çözeltisi içeren biriyle küveti değiştirin ve "SET" tuşuna basındüğmesine basın.
- bir içecek numunesinin şeker içeriğini belirlemek için, 1 dakika için 16,000 x g'de bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj 1 ml içecek numunesi yerleştirin.
Not: FRET sensör tabanlı floresans ölçümü toplam hacim içinde bulunan örnek nedeniyle sadece% 1 (h / h) numunenin özel ön-tedaviye ihtiyaç avantajına sahiptir. Ancak, floresan ölçümü (örneğin, hücreler, çözünmeyen parçacıklar, lipit, yağ veya otofloresans ile herhangi bir malzeme) etkileyebilecek herhangi bir malzeme kaldırmanızı öneririz. güçlü bir asit, kuvvetli baz, madde (deterjan) temizlenmesi veya emülsifiye edici ajan (emülgatör), yüksek konsantrasyonda mevcut olması ve FRET biyolojik sensör özelliklerini etkileyebilir, buna ek olarak, bir organik çözücü veya bir kullanılarak temizlenebilir olmalıdır neutralizeR. süt yağ ve emülsiyon yapıcılar, dondurulmuş atıştırmalıklar elenir, örneğin, numuneler, 30 dakika, ve sıvı betwee 16,000 x g'de mikrofüj tüpüne santrifüjlenirn alt sediment ve süt yağ üst tabakası ekstre edilir. heksan eşit miktarda 30 dakika lipidlerin ortadan kaldırmak için 15.000 x g'de santrifüjleme ile, ardından eklenmektedir. - 1 ml'lik şırınga ile süpernatantı ve bir şırınga filtre ile (gözenek boyutu 0.2 um) aracılığıyla filtre.
- yavaşça 0.9 ml PBS ve vorteks içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde içecek numunesinin süzüldü 0.1 ml yerleştirin.
Not: Düzgün içecek numunesinin seyreltilmesi için çok önemlidir. Şeker konsantrasyonu, cihazın dinamik aralığı içinde olacaktır, böylece bu durumda, 1000-kat seyreltme yapılmıştır. Biz içeceğin etiketinde şeker içeriğine bakarak önceden hedef şeker konsantrasyonunu tahmin öneririz. - Algılama çözeltisi 0.495 ml ihtiva eden bir küvete (% 1 v / v) ile seyreltildi içecek numunesinin 5 ul ekle.
- FRET analizörü bir küvet tutucu küvet koyun ve 53 ° C'ye kadar örnek çözümü ısıtın.
- şeker içeriği ölçmek için "SET" tuşuna basınız.
488/535 nm 7,8 de oranı okuyarak sıcaklık kontrolü için bir Peltier cihazı ile donatılmış bir çok etiketli plaka okuyucusu veya flöresanlı bir spektrofotometre kullanılarak FRET ölçümü değerlendirmek olasıdır. Sakaroz tespiti için, bir CSY-LH sensörü 2 ile 2.12 1.1 den adımları uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET analizör kullanarak şeker içeriği kantitatif analizi gerçekleştirmek için, gözlenen FRET oranı hedef şeker konsantrasyonunu tahmin donatılmış bir eğri oluşturmak için gereklidir. R 480 nm CFP emisyon yoğunluğu oranını tanımlayan ve YFP emisyon yoğunluğu 530 nm (Eq. 1) oluşturulan edelim.
(53 ° C 'de CMY-BII) FRET biyosensör doz-yanıt eğrisi, farklı şeker konsantrasyonlarda FRET oranı, r, gözlem ile üretilebilir. şöyle eğrisi S şeklinde çift kıvrımlı bir eğri olarak ifade edilebilir:
r max ve r dk sırasıyla şeker 0 konsantrasyonları ve doymuş (1,000 uM) ile sinyal oranını temsil eder; x, 0% 50 yanıt şeker konsantrasyonunu temsil eder; ve p, 1 ya da -1 yakın yanıt eğimini temsil eder. Bu çalışmada, R max, R min, X, 0, ve p de 4.256, 2.672, 71,779 ve 1, sırasıyla. 1 uM ila 1000 uM konsantrasyon aralığı uygun modelinde kullanılmıştır.
Denklem 1 ve 2 kullanarak, ticari olarak temin edilebilen içeceklerin şeker oranı FRET analizörü ile belirlendi. İki maltoz FRET sensör çeşitli sıcaklıklarda 2,8 bağlı olarak, R, bir sinyal test etmek için incelenmiştir. İlk FRET sensörü, CMY-0, N ile, CFP, maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve YFP oluşan temel bir FRET tabanlı sensörbağlayıcı peptidler o. İkinci sensör, CMY-BII, MBP ve iki floresan proteinleri 2 arasında bir Ser-Arg linker sahiptir. Şekil 1A gösterildiği gibi, 0 ve 1 mM maltoz konsantrasyonu arasında sinyal fark olduğu için, CMY-0, 50 ° C'nin altında ölçüm sıcaklıklarda gözlenmez. Her iki sinyal fark (Şekil 1) sensörler 50 ile 55 ° C arasında maksimize edilerek FRET 8. Ticari olarak temin edilebilen içecek üç tip şeker içeriği belirlenmesi için, 53- ° C'de CMY-BII sensörünün bir doz-tepki eğrisi (Şekil 2A) ve üç numune maltoz içeriği ile teşhis edildi oluşturulan maltoz konsantrasyonu FRET oranı dönüştürülmesi.
Örnek bir önemli maltoz kaynaklarıdır pirinç ve arpa gibi tahıl, yapılmış gibi, örneklem nispeten yüksek maltoz içeriği beklenen (ortalama 11,892 g / 235 ml) ( 
Çeşitli Sıcaklıklarda FRET Analyzer kullanarak 0 ve 1 mM Maltoz Arasındaki Şekil 1. FRET Sinyal Fark. (A) CMY-0 sensör 50 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda, farklı maltoz konsantrasyonlarda sinyal farklılık göstermedi. (B) CMY-BII sensör, geniş bir sıcaklık aralığı içinde 0 ve 1 mM maltoz ile FRET sinyali farkı ayırt etmek mümkün oldu. (- 55 ° C ila 50) her iki durumda da, sinyal farkı önemli ölçüde belirli bir sıcaklık aralığı içinde arttı. error çubukları standart sapmayı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2. Maltoz CMY-BII için üç ticari olarak temin edilebilen içecekler. (A) doz-yanıt eğrisinden içerik miktarının belirlenmesi. (B), üç içecek numuneleri maltoz içeriği hesaplandı. "Toplam şeker" içecek etiketinde içecek üreticisi tarafından bildirilen (maltoz dahil) tüm şeker miktarını gösterir unutmayın. Hata çubuğu standart sapmayı gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol FRET sensörler için optimal bir ısıda bir ısmarlama FRET analizörü 7 kullanarak, içecek örneklerinde şeker içeriğinin hızlı ve etkili bir ölçümü sağlar. analizörü yakın zamanda geliştirilen, ucuz 405-nm bant ışık kaynağı ve bir silikon fotodiyot iki fotodedektörlerle olarak ultraviyole-LED ile tasarlanmıştır. Bu cihaz, daha düşük maliyetli, diğer benzer Fluorometreler daha uzundur. FRET sensörler için en uygun sıcaklık aralığında iki emisyon dalga boyu bantları (530 nm ve 480 nm) oranının ölçülmesi özellikle cihaz, yüksek algılama hassasiyetini göstermiştir. Tespit çeşitli şekerler Onun duyarlılık ve şiddeti bir floresan spektrofotometre cihazının 7 daha üstün idi.
Bu protokolün ana amacı ısmarlama FRET analizörü ile FRET tabanlı sensörlerin geniş uygulama desteklemektir. analizörü dolaylı FRET sensörler vasıtasıyla şeker içeriği ölçer, bent cihaz yaygın uzatılabilir genetiği ligand özgüllük, modüler tasarımı, sensör konsantrasyonu bağımsız sinyaller ve hücre içi küçük moleküllerin doğru hedefleme dahil FRET sensörleri, faydaları bir dizi içeriyor olduğu açıktır. FRET sensörler Aslında iyonları 9, heme 10, ve diğerleri de dahil olmak üzere bir küçük moleküller geniş bir tespit etmek için kullanılır. Ayrıca, FRET yapıları 20'den fazla çeşit kolayca bulunabilir ve kar amacı gütmeyen emanetçi Addgene 11 üzerinden sipariş edilebilir.
FRET analizörü geniş uygulanabilirliği rağmen, cihazın çalışması ile iki ana sorunlar vardır. Cihazın çalışması nispeten basit olduğundan Birincisi, örnek ön işleme cihazı arıza durumları haricinde, algılama kalitesini etkileyen kritik bir adımdır. Bu protokol, bir adım (örnek seyreltme) açıkça saydam sıvı örnekleri işlemek için yeterli olduğunu ve hiçbir çözünmez Parti'yi içeriyordukartılması. Bununla birlikte, diğer örnekleri, hücresel ya da lipid bileşenleri gibi çözünmeyen malzemeler, kaldırma ek bir işlem gerektirebilir. Adım 2.7 aşağıdaki belirtildiği gibi FRET sinyalini etkileyebilir herhangi autofluorescent parçacıklar da, kaldırılması gerekir. İkinci olarak, kalite kontrol ve hastane bilgi sistemleri ile arabirim bağlantı noktası bakım test (POCT) araçlar 12 her türlü olduğu gibi, ele alınması gerekmektedir. FRET analizörü sinyal kalitesi büyük ölçüde FRET sensör kalitesi ve önişleme adımlara bağlı olduğundan, düzenli kalite kontrol denetimleri ölçümleri düzenli kalite kontrol veri analizi için standart sinyal aralığında kalmasını sağlamak için gereklidir. daha güvenilir bir uygulama için gerekli olan, her ikisi de, FRET sensör stabilite ve depolama süresi, kalite kontrol kontroller sırasında araştırılmalıdır. Uygun yazılım kurallarına oluşturma ve geliştirme de bağlantı sınırlama ele alabilir. Güncel sürümleriFRET analizör uzaktan komut satırı kontrolü için RS232 bağlantısı ile donatılmıştır, ancak kablosuz iletişim hastane bilgi sistemleri için geliştirilmiş bir arayüze sahip olacak analizörü sonraki sürümü, bir özelliği olabilir.
Ancak, FRET sensörler, substrat özgüllüğü için normalde daha geniş özgüllük 2 sağlayan bir yaklaşım tasarlanmış edilmiştir. Sonuç olarak, FRET sinyal ticari içeceklerde şekerlerin diğer türleri de dahil olmak üzere diğer maddeler, gelen istenmeyen girişim karşılaşabilirsiniz. Başka araştırmalar da doğru şeker miktarını ölçmek için çeşitli şeker karışımları nasıl yanıt FRET sensörler araştırmalıdır. içecek üreten firmalar ile işbirliği FRET analizörü kalibre etmek için şeker içeriği teyit yardımcı olacaktır.
Çeşitli FRET sensörleri ile önerilen taşınabilir FRET cihazı POCT uygulamalarda kullanılabilir olacağı tahmin edilmektedir. POCT gebelik, kan değerlendirmek için kullanılırglukoz düzeyleri, Biyomarker proteinler, bulaşıcı bakteri ve bulaşıcı virüsler. POCT yöntemler hızlı dönüş süreleri var ve genellikle işlem adımlarının az sayıda nedeniyle düşük hata oranları sergilerler. Bu merkez laboratuvar testleri yaklaşımının üzerinde POCT önemli avantajlarıdır. Bu, burada tarif edilen cihaz gibi el taşınabilir POCT cihazları nedeniyle gıda değerlendirme ve kan şekeri izleme potansiyel uygulamaların artan ilgi çekmektedir. Özel olarak, diyabetli hastalarda kan örnekleri glukoz izleme hızlı, doğru ve uygun maliyetli POCT yöntemi 13 gerektirir. Ames araştırma ekibi (glikoz oksidaz içeren bir şerit kullanarak) 1965 yılında ilk kan şekeri test şeridi geliştirdikten sonra, çeşitli teknolojiler kan şekeri izleme amacıyla 12 önerilmiştir. FRET analizörü kan ve periplazmik glikoz bağlayıcı Protei uygun ön işleme ile kan örneklerinde glukoz tespit etmek de mevcutturN (MglB) 14 merkezli bir FRET proteini.
Gıda kalite değerlendirme için basit, hızlı yöntemlere ihtiyaç vardır. Şeker içeren içecek tüketimi, artırılmış vücut kitle çocukluk 15 endeksi, pediatrik obezite 16 ve inme 17 riski olarak hastalık ve sendrom, çeşitli ile ilişkilidir. Bu bağlantıyı anlamak içeceklerde şeker bileşenleri doğru ölçüm gerektirir. Bu nedenle, içecek glikoz ve fruktoz konsantrasyonu insan sağlığı ile ilgili bilim adamlarının ilgisini bulunmaktadır. Bu protokol optimum sıcaklık kontrolü ile FRET analizörü son derece hassas bir performans gösteriyor. Cihaz glikoz ve fruktoz 14,15 dahil olmak üzere çeşitli küçük moleküller olan tespit etmek için çeşitli FRET sensörler kullanılabilir. 10 bir pil ömrü var Bizim taşınabilir ve şarj edilebilir cihaz, - ısıtma protokole bağlı olarak, 20 saat, POCT için geçerlidir. Basit operasyonel protokol makes kolay cihaz kullanımı ve karmaşık personel eğitim ihtiyacını ortadan kaldırır. ekipman boyutunun azaltılması, tedavi öncesi adımların azaltılması ve alan kullanımı için pratik ihtiyaçlarının belirlenmesi de dahil olmak üzere teknik gelişmeler ile, bu cihaz küçük ölçekli laboratuvar ortamlarında FRET merkezli araştırma gelişimini teşvik edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Küresel Frontier Projesi (2011-0031944) ve KRIBB Araştırma Girişimi Programı Akıllı Sentetik Biyoloji Merkezi'nden hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).
