Summary
We beschrijven een high-throughput, multiplex en gerichte proteomische cerebrospinale vloeistof (CSF) test ontwikkeld met potentieel voor klinische toepassing. De test kan kwantificeren potentiële markers en risicofactoren voor neurodegeneratie zoals de apolipoproteïne E varianten (E2, E3 en E4), en de allelische expressie te meten.
Abstract
Veel neurodegeneratieve ziekten nog ontbreken effectieve behandelingen. Betrouwbare biomarkers voor het identificeren en classificeren van deze ziekten is belangrijk in de ontwikkeling van toekomstige nieuwe therapieën. Vaak potentiële nieuwe biomarkers niet maken in de kliniek als gevolg van beperkingen in hun ontwikkeling en hoge kosten. Echter, gerichte proteomics behulp Multiple Reaction Monitoring vloeistofchromatografie-tandem / massaspectrometrie (MRM LC-MS / MS), in het bijzonder via triple quadrupole massaspectrometers, is een methode die kan worden gebruikt om snel evalueren en valideren van biomarkers voor klinische toepassing in diagnostische laboratoria . Traditioneel is dit platform uitgebreid gebruikt voor het meten van kleine moleculen in klinische laboratoria, maar het is de mogelijkheid om eiwitten te analyseren, waardoor het een aantrekkelijk alternatief voor ELISA (Enzyme-Linked Immunosorgebogen Assay) gebaseerde methoden. We beschrijven hier hoe gerichte proteomics kan worden gebruikt om multiplex merkers van dementie, waaronder de detectie en kwantificering van het bekende risicofactor apolipoproteïne E isoform 4 (ApoE4) te meten.
Om de test geschikt is voor translatie te maken, is het ontworpen snelle, eenvoudige, zeer specifiek te zijn en kosteneffectief. Hiertoe moet elke stap in de ontwikkeling van de test worden geoptimaliseerd voor de individuele eiwitten en weefsels ze geanalyseerd. Deze methode beschrijft een typische workflow waaronder diverse tips en trucs om een gerichte proteomics MRM LC-MS / MS vertaling .
De methode ontwikkeling is geoptimaliseerd met behulp van aangepaste gesynthetiseerde versies van tryptische quantotypic peptiden, waarbij de MS kalibreren voor detectie en vervolgens verrijkt in CSF om correcte identificatie van de endogene peptide te bepalen in de chromatografische scheiding vóór de analyse in de MS. Om absolu te bereikente kwantificering stabiele isotoop gemerkte interne standaard versies van de peptiden met korte aminozuursequentie labels en met een trypsine splitsingsplaats, zijn opgenomen in de test.
Introduction
De groeiende invloed van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Lewy Body dementie en de ziekte van Parkinson, wordt een sociaal-economisch probleem in veel landen 1. Er is behoefte aan extra biomarkers die kunnen worden gebruikt voor het identificeren en classificeren van patiënten in de vroege stadia van de ziekte, en eventuele nieuwe behandelingen te volgen. Het algemene doel van deze methode is om een generieke pipeline een gestroomlijnde, economische en snellere manier valideren potentiële CSF markers van neurodegeneratie. 'Logisch gerichte proteomics of peptide MRM LC-MS / MS als een gemakkelijk wijzigbaar methode meerdere potentiële eiwitbiomarkers beoordelen van de ontdekking experimenten. Deze kunnen verder worden gemultiplext via een snelle chromatografische scheiding (<10 min) en beoordeeld. Binnen deze multiplex scherm voor neurodegeneratieve biomarkers, hebben we de bekende dementie risicofactor apolipoproteïne E4 isoform (ApoE4) inbegrepen, zodat we can bepalen tegelijkertijd de status en het niveau van meningsuiting, door dat het elimineren van de noodzaak van een aparte genotyperingstests 2. LC MS / MS wordt routinematig gebruikt als voorkeursmethode voor het nauwkeurig kwantificeren van kleine moleculen via andere werkwijzen zoals ELISA of radioimmunoassay (RIA). Deze verschuiving in het gebruik van MS technologie voor het analyseren van eiwitten is voornamelijk gevolg van problemen met de immuno-gebaseerde technologieën. Deze omvatten cross-specificiteit, variatie tussen charges, beperkte houdbaarheid, en de hoge kosten. Daarom richt proteomics snel een groeiende alternatief voor antilichaam-gebaseerde werkwijzen zoals Western blotting, ELISA en RIA. De mogelijkheid om veel merkers multiplexen in een assay is het belangrijkste voordeel van deze techniek immuno-gebaseerde methoden 3. De techniek is toepasbaar op vele weefsels en is gebruikt als valideringsstrategie vele proteomics studies zoals plasma en urine 4 5,6.
de technique kunnen worden toegepast in elk laboratorium waar toegang en expertise in het gebruik triple quadrupole massaspectrometers heeft. Peptide ontwerp is relatief eenvoudig met het toenemende gebruik van open source databases. De concurrentie op de markt van aangepaste peptiden synthese maakt ze veel meer betaalbaar. Zware peptiden zijn echter duur en dus de markers moet worden beoordeeld kleine cohort alvorens op grotere schaal. Er is groeiend potentieel de techniek te gebruiken in de klinische diagnostische instellingen meeste grote ziekenhuizen met drievoudige quadrupool platforms die gemakkelijk kan worden aangepast om gerichte proteomische assays werking. Een dergelijke toepassing van de werkwijze, waardoor het in de routine diagnostische setting, is de recente toepassing hielprik voor sikkelcelanemie 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP:. Een schema van de totale protocol hier beschreven wordt gegeven in Fi guur 1 All gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode monsters zijn surplus klinische diagnostische monsters en hebben ethische goedkeuring van de London Bloomsbury ethische commissie.
Figuur 1. Schematische illustratie van het totale proces van het creëren van een gerichte CSF MRM LC-MS / MS Assay. Candidate marker peptiden voor de evaluatie zijn geselecteerd uit eiwit targets. Door het gebruik van aangepaste gesynthetiseerde peptiden, is een gerichte LC-MS / MS methode multiplex gemaakt. Na evaluatie kan de test worden gebruikt om de effectiviteit van mogelijke markers van neurodegeneratie te evalueren.
1. Peptide Selection and Design
LET OP: Criteria voor een marker peptide is dat het uniek moet zijn (proteotypic (quantotypic). Om te bepalen of een peptide uniek is of niet, de 'blast' search tool op de Uniprot website (http://www.uniprot.org/blast/) kan worden gebruikt.
- Een lijst van doeleiwitten (markers), dwz Define, ApoE (zie tabel 2).
LET OP: Als de markering is geïdentificeerd uit eerdere proteomics profiling experimenten 8, selecteer vervolgens het peptide dat de beste reactie van die data set geeft. - Als deze informatie niet beschikbaar is, gebruik van open source websites, zoals in silico trypsine vertering van doeleiwitten, met behulp van een software tool zoals MS-Digest.
- Kies het peptide dat tryptische en ongevoelig voor translationele modificaties plaatsen.
OPMERKING: Deze informatie kan worden gecontroleerd op de Uniprot website www.uniprot.org. Vermijd peptiden gevoelig voor chemische modificatie tijdens de LC-MS monstervoorbereiding. <li> Bestel de aangepaste synthese van de gekozen peptiden.
LET OP: Marker peptiden kunnen op maat worden gesynthetiseerd door verschillende commerciële bedrijven. Voor ApoE de quantotypic peptide gebruikt om de totale ApoE te meten was vastbesloten om AATVGSLAGQPLQER zijn. De proteotypic peptide die worden gebruikt om de E2 en E4-varianten te bepalen zijn de tryptische peptiden voor de positie 158 (RLAVYQAGAR en CLAVYQAGAR) en positie 112 (LGADMEDVCGR en LGADMEDVR), respectievelijk.
2. Voorbereiding van Standard Peptiden
Opmerking: Om de beste kwantitatieve overgangen selecteren, de detectie van de matrix (CB) moet worden geoptimaliseerd. De meest efficiënte manier optimaliseren gemultiplexte peptiden om pools van de peptiden te creëren bij bekende concentraties. Deze pools kunnen vervolgens worden gebruikt voor methodeontwikkeling en standaard curves.
- Resuspendeer synthetische peptiden (peptide details worden gegeven in tabel 2) tot 1 mg / ml voorraadoplossingconcentratie volgens de instructies van de fabrikant. Standaard, indien de instructies niet beschikbaar zijn, resuspendeer peptiden in 50:50 (v / v) acetonitril (ACN) / H 2 O.
- Bereid de 1:10 verdunningen van het peptide uit de voorraad concentratie en het zwembad 1000 pmol van elk peptide in een lage bindende microcentrifugebuis. Droog in een speed-vac concentrator de finale zwembad en bewaar bij -20 ° C. Bereid je verschillende zwembaden voor toekomstig gebruik.
- Aliquot 100 ul CSF in een lage binding buizen. Vriesdrogen het CB.
- Resuspendeer een hoeveelheid van gepoolde 1000 pmol peptiden digestie buffer (100 mM Tris HCl, pH 7,8, 6 M ureum, 2 M thioureum, 2% ASB14) om concentraties van 10 en 1 pmol / pl te verkrijgen.
- Spike de samengevoegde peptiden in het gevriesdroogde 100 gl aliquots van CSF op 0, 1, 2, 5, 10 en 15 pM concentraties. Voeg 20 ng verbonden intacte eiwit zoals enolase gist te treden als een interne standaard en controle voor faatontsluitrendement stkypsin.
- Vul de CSF monsters met verteren buffer tot een eindbedrag van 20 pi. Vortex.
- Voeg 1,5 ui dithiothreïtol (30 mg in 1 ml 100 mM Tris HCl, pH 7,8) toe en schud bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Voeg 3 ul van joodaceetamide (35 mg in 1 ml 100 mM Tris HCl, pH 7,8) toe en schud bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten in het donker.
- Voeg 165 ul van DDH 2 O.
- Voeg 10 ul van 0,1 ug / ul sequentie rang gemodificeerd trypsine oplossing geresuspendeerd in 50 mM ammoniumbicarbonaat, pH 7,8. Incubeer in een waterbad bij 37 ° CO / N en de vertering stop bevroren monsters. Store verteert bij -20 ° C tot klaar om te analyseren.
3. Optimalisatie van MS Peptide Detection
- Kopieer en plak de sequentie van het peptide worden geoptimaliseerd, in een geschikte software, bijvoorbeeld, Skyline 9. Op de peptidesequentie de informatie te verkrijgenverwachte precursorion massa en productionen.
- Verdun de peptiden uit voorraad concentratie (zie paragraaf 2.1) verder tot 1 ng / ml concentratie MS methode ontwikkeling.
- Direct trekken de peptiden in de massaspectrometer op optimale stroomsnelheid (gewoonlijk 0,1-0,8 ml / min) en met 0-5% botsingsenergie.
- Verwerven MS spectrum om de experimentele meervoudig geladen ionen precursor 8 identificeren. Kies de voorloper ion (m / z) die de meeste intensiteit (doubly- of drievoudig geladen ionen voorloper wordt geadviseerd) geeft.
- Reinfuse het peptide en toepassing botsingsenergie aan het peptide door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) fragment. Optimaliseren van de kegel en botsing energieën om de beste fragmentatie patroon te verkrijgen (fragment ionen enkelvoudig of dubbel geladen, en de massa van fragment ion bij voorkeur groter zijn dan ouder ion, wordt geadviseerd).
- Controleer of de experimenteel verkregen overgangen overeenkomen met overgangen gegenereerd in silico </ Em> (zoals beschreven in stap 3.1). Sla de overgang lijst in het MRM methode bestand met minstens 2 meest intense overgangen per precursor ion. 2 overgangen omvatten: 1 kwantificatie en 1 bevestiging in de uiteindelijke assay.
OPMERKING: Sommige MS fabrikanten hebben een functie (dat wil zeggen, Waters IntelliStart) voor geautomatiseerde MRM of SRM-analyse optimalisatie. Indien mogelijk bezielen peptiden met een gecombineerde mobiele fasen bij 50-70% ACN met 0,1% FA.
4. LC-MRM Method Development
OPMERKING: Analyseer het mengsel van synthetische peptiden met een Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) gekoppeld met drievoudige quadrupool massaspectrometer. Zorg ervoor dat de bron is schoon. Oplosmiddel A is DDH 2 0 met 0,1% FA; Oplosmiddel B is ACN met 0,1% FA.
- Gebruik het LC-MS systeem voorzien van een UPLC kolom gepakt met C-18-fase (1,6 urn diameter, 90 Å poriën, 2,1 mm x 50 mm lengte) en bevestigd aan een pre-kolom van dezelfde fase. </ Li>
- Ontdooien CSF verteert op ijs, centrifuge bij 16.000 g gedurende 10 min en de overdracht 60 ul in 300 ul glazen insert flesjes en bewaar de rest heen bij -20 o C.
- Spuit de hoogste concentratie van de standaard curve punt met behulp van 10 min 1-40% ACN lineair verloop (zie tabel 1 voor het verloop instellingen)
- Open het resulterende chromatogram en retentie note tijd en top twee meest intense (kwantitatief) overgangen per peptide met alle overgangen gemaakt in stap 3.
- Op basis van deze informatie, werkt een 10 min MRM methode (gemaakt in stap 3.6) met getimed kanalen om peptiden (zie figuur 2 voor een voorbeeld) te meten. Gevoeligheid behouden blijven elk kanaal punten per piek groter dan 8 en tijd groter dan 0,01 seconden voor tenminste één overgang per peptide wonen.
- Onder 'oplosmiddel vertragingen in de MRM methode: een aan het begin tot 10 seconden voordat de eerste piek elutie eneen aan het einde van de werkwijze, 20 seconden na de laatste piek elutie. Doe dit door te kiezen voor "solvent vertragingen" in methode gebeurtenissen in MS methode bestand.
- Voer de standaard curve door de getimede MRM-methode en ervoor zorgen dat er geen storende niet-specifieke pieken met overgangen (gegenereerd in stap 3.6) door te controleren op lineariteit.
- Bepalen of de peptiden gedetecteerd door het uitvoeren van non-spiked samengevoegde en ziekte CSF door de methode.
- Verwijder de peptiden die onder de detectiegrens van de assay.
Figuur 2. Voorbeeld van een Dynamic MRM MS-methode. Timed kanalen van peptide overgangen kunnen worden gegroepeerd op basis van vastgestelde retentietijden. Het inschakelen van mrms in een getimede mode te worden opgenomen als de geselecteerde markering peptiden elueren uit de chromatografiekolom, minimaliseert het aantal transitions gedurende een tijdsperiode en verhoogt de gevoeligheid van de test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Toevoeging van interne standaarden
OPMERKING: Zoals eerder 10 beschreven, kunnen stabiele isotoop gemerkte interne standaarden in de test worden opgenomen. Als gevolg van de kosten van deze normen, is het raadzaam om eerst de peptiden in de matrix te beoordelen.
- Bepaal het ideale peptiden geoptimaliseerd voor detectie in CSF: Kies de peptiden die de meest voorkomende zijn, met de hoogste intensiteit onder tussenkomst pieken.
- Ontwerp overeenkomend peptiden aan zware 13 C 15 N aminozuur labels die de massa van het peptide met tenminste 6 Da opzichte van endogene peptide omvatten. Ook, voeg een tag van 4-6 additionele aminozuren aan ofwel het N- of C-uiteinde van de zware peptide te controleren voor tryptische digestie.
- Verdun stabiele isotoop gemerkte interne standaarden bij de spijsvertering buffer (zie stap 2.4). Bepaal de ideale hoeveelheid van stabiele isotoop gemerkte interne standaard die in CSF zal worden verrijkt door spiking op verschillende niveaus, afhankelijk van de abundanties eerder waargenomen tijdens de ontwikkeling. Doel te bereiken ongeveer 1: 1 verhouding van stabiele isotoop gemerkte standaard endogeen peptide.
OPMERKING: Stabiele isotoop gemerkte interne standaarden kunnen worden gesynthetiseerd door diverse commerciële bedrijven.
6. LC-MRM Assay van CSF patiëntenstalen
- Spike geoptimaliseerde hoeveelheid stabiele isotoop gemerkte standaarden in 100 ul CSF en vriesdrogen van het mengsel.
- Resuspendeer de CSF in 20 ul van digest buffer en de spijsvertering te voeren, zoals beschreven in de punten 2,7-2,10.
- Analyseer de monsters met behulp van LC-MRM methode ontwikkeld in stap 4.
- Voor kwantitatieve analyse uitvoeren van de standaard pepgetijden in concentraties van 0 -15 pmol in een standaardcurve. Zie stap 2,5 voor de bereiding van standaardcurve.
7. Data Analysis
OPMERKING: Kwantitatieve gegevens is gebaseerd op de intensiteit verhouding van de baseline piek interne standaarden (zwaar gelabelde peptiden). Gedetailleerde informatie over SRM / MRM data-analyse werd eerder beschreven 10. Verhouding gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt in een standaardcurve absolute te bepalen of berekenen ze van de toegevoegde concentratie van zware-gemerkt peptide.
- Analyseer LC-MRM gegevens met behulp van standaard software van de massaspectrometers fabrikant 10. U kunt ook gebruik maken van de Horizon van software om kwantitatieve MRM data 10 te analyseren.
- Controleer de gevoeligheid van de run door het controleren van de respons van een interne standaard, zoals het verrijkte gist enolase of een stabiele isotoop gemerkte standaard in elke run. Zorg ervoor dat de variatiecoëfficiënt (CV) niet groter is dan25%.
- Handmatig controleren van de gegevens annotatie om de nauwkeurigheid te waarborgen. Analyseer elk peptide en de verhouding een geschikte stabiele isotoop gemerkte interne standaard, dat wil zeggen, de stabiele isotoop gemerkte versie van de peptide te gebruiken zo beschikbaar.
- Om absolute waarden van pmol per 100 ul CSF te verkrijgen, voert u de verhouding data door middel van passende standaard curven die tegelijk werden uitgevoerd.
- Bereken de variatiecoëfficiënt (CV). CV voor elk peptide moet onder 25% en minder dan 15% hoge overvloedige peptiden.
OPMERKING: Absolute waarde pmol per 100 ul CSF waarden kunnen gebruikt worden in de daaropvolgende downstream statistische analyse.
8. apolipoproteïne E Isoform Status
OPMERKING: ApoE isoform ervan te bepalen, kan de aanwezigheid van de overeenkomstige peptiden worden uitgevoerd door het bepalen van de aanwezigheid van elke isovorm.
- Denk aan de ApoE in 100 ul CSF drempel van> 1000 signaal-to-noise als positief voor dat peptide. Zie Figuur 5 voor de gewenste peptiden / afwezig isovorm status van een patiënt te bepalen. Bepaal de allelische expressie door het berekenen van het% van elke isovorm tot totaal ApoE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de methode hierboven beschreven een high throughput 10 min multiplex assay bestaat uit 74 peptiden uit 54 eiwitten werd ontwikkeld als een test voor markers van neurodegeneratieve aandoeningen de ziekte van Alzheimer en Lewy Body Dementie (LBD) 8. Figuur 3 toont een multiplex chromatogram gepubliceerd eerder 8 van de belangrijke peptide markers van de test. De peptiden in de assay en de kwantitatieve overgangen worden in tabel 2. De gegenereerde deze methode gegevens verstrekken genormaliseerde verhoudingen de desbetreffende stabiele isotoop gemerkte interne standaard. Deze waarden kunnen dan door een standaardcurve te maken aan absolute pmol / 100 ul CSF concentraties te bepalen. Deze waarden kunnen vervolgens statistisch geanalyseerd op veranderingen in klinische monsters.
Zoals eerder beschreven 8, kwantificering van de 74 peptides opgenomen in deze CSF test bleek dat 25 van deze markers significant in de CSF van dementie patiënten werden gewijzigd. Om de effectiviteit van deze test illustreren de resultaten van eerder beschreven dementie markers Pro-Orexin en YKL chitinase 3-achtig proteïne (YKL-40) 11,12 zijn aangegeven in figuur 4. De geïntegreerde ApoE assay worden de ApoE isoform / allele status de patiënt ook. Apo E4 is een bekende risicofactor voor de ziekte van Alzheimer, waarbij deze dan in de test zal waardevolle informatie. De detectie van de ApoE isovormen wordt toegelicht in figuur 5 en is gebaseerd op de detectie van de overeenkomstige peptiden van de aminozuurveranderingen voor isovormen E2 (R158C) en E4 (C112R). Figuur 5A toont de piekpatroon verwacht voor elke isovorm combinatie en figuur 5B toont het resultaat van een CB getest met de test op patiëntenmonsters.
Figuur 3. Representatieve Bedekte MRM Chromatogrammen. Herdruk van Heywood et al. 8 Biomarkers belangrijk voor de neurodegeneratieve aandoeningen Lewy body dementie en de ziekte van Alzheimer 8 worden getoond op een 10 min LC verloop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Voorbeeld gegevens. Herdruk van Heywood et al. 8 grafieken tonen hoe de beschreven MRM LC-MS / MS methode betrouwbaar kan kwantificeren en onderscheiden van de controles bekende neurodegeneratieve merkers zoals YKL chitinase 3-achtig proteïne (YKL-40) 11 , 12 en de AD marker Pr o-Orexin 13. AD = Ziekte van Alzheimer, Lewy Body LBD = dementie en de ziekte PD = Parkinson. Gegevens die eerder zijn gepubliceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Illustratie van hoe het Apo E Isoform van een patiënt kan worden bepaald. A. Geeft de peptiden die de 112 aminozuurvolgorde LGADMEDVCGR voor neutrale (E3a) of LGADMEDVR op de aanwezigheid van E4 en voor de positie 158 tot RLAVYQAGAR de neutrale detecteren (E3b) of CLAVYQAGAR de E2 isovorm. B. Peptiden van de ApoE sequentie worden weergegeven in het linkervenster. De verschillende combinaties van de gedetecteerd in de CSF peptiden kunnen de ApoE isoform status aan te geven.bestanden / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijd | Stroom (ml / min) | % EEN | % B | Kromme |
| Eerste | 0.8 | 97 | 3 | eerste |
| 0.2 | 0.8 | 97 | 3 | 6 |
| 0.8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7.01 | 0.8 | 0.1 | 99.9 | 6 |
| 8 | 0.8 | 0.1 | 99.9 | 6 |
| 8.01 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
| 10 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Tabel 1. UPLC Gradient instellingen voor een 10 min Methode. A = DDH 2 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA
Tabel 2. Peptiden Inclusief CSF MRM LC MS / MS Analyse. Getoond worden alle opgenomen gebruikte peptiden in de werkwijze, beschreven en gepubliceerd 8. Vermelding of de markering op betrouwbare wijze werd ontdekt in 100 ul CSF wordt aangegeven. Overgangen gelabeld in vet zijn degenen gebruikt voor kwantitatieve gegevens. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals bij alle MS gebaseerde testen, de kritische stappen in de werkwijze de bepaling van de juiste en nauwkeurige hoeveelheden interne standaarden. Als absolute kwantificatie wordt gebruikt, dan is de juiste hoeveelheden spiked peptiden in de standaardkromme zijn ook kritisch.
Onze assay niet het neerslaan van het CSF of het gebruik van elke soort opruimen of ontzouting stappen voorafgaand aan MS analyse nodig - het is een volledig éénpotsreactie methode. Door de geringe omvang van CSF en de beperkte complexiteit (in vergelijking met plasma), is gevonden dat deze stappen van het uiteindelijke protocol kan worden verwijderd, waardoor de test vereenvoudigen en waardoor het geschikt is voor vertaling in diagnostische setting. De insluitsels van een pre-kolom om de belangrijkste analytische kolom en het oplosmiddel vertragingen bij de MS methode, toereikend om de gevoeligheid tijdens de MS handhaven duren dan 500 monsters zijn. Als de test-UPLC running tijd is kort, is het belangrijk om ondubbelzinnig identificeren van de juiste piek in de CSF verteren matrix.
Dit kan alleen worden bereikt met het gebruik van verrijkte gesynthetiseerde peptiden en een standaardcurve. Als er een onzekerheid van een peptide afgestemd op de juiste chromatografiepiek is dan kan het nuttig zijn om het monster door middel van meerdere overgangen lopen en controleer de overgangen intensiteit patroon met de synthetische normen. Al onze tests ten minste 2 peptiden overgangen naar de identiteit van het peptide te bevestigen.
Het assay is ontwikkeld voor merkers gedetecteerd tot 100 ui CSF. Voor sommige andere merkers van dementie, kan een groter volume CSF nodig. Een andere beperking van de assay is de kwestie van dynamisch bereik van eiwitexpressie. Sommige overvloedige markeringen moeten worden geïnjecteerd op de massa spectrometer in kleinere hoeveelheden, terwijl enkele laag overvloedige markeringen vereisen groter injectievolume. Daarom is de sample moet tweemaal worden geïnjecteerd.
Het belang van deze techniek is de mogelijkheid om multiplexen en de verhoogde specificiteit van de 3 niveaus van identificatie via antilichamen (retentietijd precursor product en m / z). Vanuit het perspectief van klinische toepassing, het grootste voordeel is de mogelijke kostenbesparing op antilichamen, maar in de startfase van de massaspectrometrie apparatuur en geschoold personeel vereist. Ander voordeel is de snelheid waarmee de werkwijze kan worden vertaald naar de drievoudige quadrupool gebaseerde systemen. Dit versnelt aanzienlijk vermogen te vertalen en valideren van een test in vergelijking met alle immuno-gebaseerde technieken. Ten slotte, zoals dit platform en expertise is routinematig gebruikt om kleine moleculen klinisch meten, veel grote ziekenhuis centra hebben al deze infrastructuur in de plaats. Op het gebied van neurodegeneratie is er veel aandacht en de noodzaak van nieuwe biomarkers in CSF en serum. Deze werkwijze verschaft een plaTForm een high-throughput assay waar de toekomstige markers kunnen toegevoegd worden (en verwijderd) worden beoordeeld op effectiviteit, enz. Deze techniek heeft verder toepassing op andere weefsels van ApoE isoform identificatie, zoals plasma reeds beschreven 2 en zelfs bloedvlekjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V.
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
