Summary
Wir beschreiben ein Hochdurchsatz-Multiplex, und gezielte proteomic Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) -Assay mit Potential für klinische Umsetzung entwickelt. Der Test kann für Neurodegeneration, wie Apolipoprotein E-Varianten (E2, E3 und E4), und messen deren allelische Expression potentielle Marker und Risikofaktoren zu quantifizieren.
Abstract
Viele neurodegenerative Erkrankungen fehlen noch wirksame Behandlungen. Zuverlässige Biomarker für die Identifizierung und Klassifizierung dieser Krankheiten wird in der Entwicklung zukünftiger neuer Therapien wichtig sein. Oft potentielle neue Biomarker machen es nicht in die Klinik wegen der Beschränkungen in ihrer Entwicklung und hohen Kosten verbunden. Allerdings gezielte Proteomik Multiple Reaction Monitoring-Flüssigchromatographie-Tandem / Massenspektrometrie (MRM LC-MS / MS) unter Verwendung, insbesondere Triple-Quadrupol-Massenspektrometer verwendet wird, ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um schnell auszuwerten und zu bestätigen Biomarker für die klinische Umsetzung in diagnostische Laboratorien . Traditionell wurde diese Plattform extensiv für die Messung von kleinen Molekülen in klinischen Laboratorien verwendet worden, aber es ist das Potential Proteine zu analysieren, dass es eine attraktive Alternative zu ELISA (enzyme-linked Immunosor machtgebogen Assay) -basierte Methoden. Wir beschreiben hier, wie gezielte Proteomik eingesetzt werden können Multiplex-Marker der Demenz zu messen, einschließlich der Nachweis und die Quantifizierung des bekannten Risikofaktor Apolipoprotein E-Isoform 4 (ApoE4).
Um den Test geeignet für die Übersetzung zu machen, ist es entworfen, schnelle, einfach zu sein, hochspezifische und kosteneffektiv. Um dies zu erreichen, muss jeder Schritt in der Entwicklung des Assays für die einzelnen Proteine und Gewebe optimiert werden sie analysiert werden. Diese Methode beschreibt ein typischer Arbeitsablauf, einschließlich verschiedener Tips und Tricks zu entwickeln für die Translation eine gezielte Proteomik MRM LC-MS / MS .
Die Methodenentwicklung wird unter Verwendung von optimierten benutzerdefinierten synthetisierten Versionen von tryptischen quantotypic Peptide, die die MS zur Detektion kalibrieren und dann versetzt in CSF korrekte Identifizierung des endogenen Peptid in der chromatographischen Trennung vor der Analyse in den MS zu bestimmen. Um das zu erreichen absolute Quantifizierung, stabilen Isotopen-markierten internen Standard-Versionen der Peptide mit kurzen Aminosäuresequenz-Tags und eine Trypsinspaltstelle enthalten, werden in dem Test enthalten.
Introduction
Die zunehmende Bedeutung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, Lewy - Körperchen - Demenz und Parkinson-Krankheit, wird zu einer sozio - ökonomischen Problem in vielen Ländern 1. Es besteht ein Bedarf an zusätzlichen Biomarkern, die verwendet werden können, um Patienten in den frühen Stadien der Krankheit zu identifizieren und zu klassifizieren, und mögliche neue Behandlungen zu überwachen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine generische Pipeline für eine schlanke, wirtschaftliche und schnelleren Weg der Validierung Potential CSF-Marker der Neurodegeneration zu erstellen. Der Grund dafür ist, gezielte Proteomik oder Peptid MRM LC-MS / MS als leicht abänderbar Methode zu verwenden, um mehrere potentielle Protein-Biomarkern von der Entdeckung Experimente beurteilen. Diese können weiter über einen schnellen chromatographischen Trennung gemultiplext werden (<10 min) und bewertet. In diesem Multiplex-Bildschirm für neurodegenerative Biomarkern haben wir die bekannten Demenz Risikofaktor Apolipoprotein E4-Isoform (ApoE4) enthalten, so ca wirn bestimmen gleichzeitig ihren Status und Umfang der Expression, durch das 2 die Notwendigkeit für separate Genotypisierungstests beseitigen. LC MS / MS wird routinemäßig als Methode der Wahl verwendet zur genauen Quantifizierung kleine Moleküle gegenüber anderen Methoden, wie ELISA oder Radioimmuntest (RIA). Diese Verschiebung in der Verwendung von MS-Technologie zur Analyse Proteine wurde hauptsächlich durch Probleme mit der immuno-basierten Technologien angetrieben. Dazu gehören Kreuzspezifität, Chargenstreuung, begrenzte Haltbarkeit und hohe Kosten. Daher wird gezielt Proteomik schnell eine wachsende Alternative zu Antikörpern basierende Verfahren wie Western-Blot, RIA und ELISA werden. Um jedoch die Fähigkeit , viele Markierungen in einem Assay multiplexen ist der große Vorteil dieser Technik gegenüber immuno-basierten Verfahren 3. Die Technik ist anwendbar auf viele Gewebe und wurde als eine Validierungsstrategie für viele Proteomstudien einschließlich Plasma und Urin - 4 5,6 verwendet.
Die technique kann zu jedem Labor angewendet werden, die sich mit der Triple-Quadrupol-Massenspektrometer Zugang und Know-how verfügt. Peptid-Design ist relativ einfach mit dem wachsenden Einsatz von Open-Source-Datenbanken. Der Wettbewerb geprägten Markt der kundenspezifischen Peptiden Synthese macht sie viel günstiger. Schwere Peptide, sind jedoch teuer und daher sind die Marker sollten in einem größeren Maßstab, bevor er auf einen kleinen Kohorte beurteilt werden. Es gibt immer mehr Potenzial für die Technik, die in den klinischen Diagnoseeinstellungen verwendet werden, wobei die meisten großen Krankenhäuser Triple-Quadrupol-basierten Plattformen, die die leicht angepasst werden kann, um gezielt Proteom-Assays laufen. Eine solche Anwendung des Verfahrens wird es in die Routinediagnostik Einstellung vornehmen, ist die jüngste Anwendung Neugeborenen Blutfleck - Screening für Sichelzellenanämie 7.
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Protocol
. HINWEIS: Ein Schema des hier beschriebenen allgemeinen Protokoll in Bild 1 angegeben Alle Proben für die Entwicklung dieser Methode verwendeten Überschuss klinischen diagnostischen Proben und haben ethische Genehmigung von der Londoner Bloomsbury Ethikkommission.
Abbildung 1. Schema , den Gesamtprozess der Erstellung eines Targeted CSF MRM LC-MS / MS - Assay. Kandidatenmarkerpeptide für die Bewertung werden von Protein - Targets ausgewählt. Durch den Einsatz von kundenspezifischen synthetisierten Peptide eine gezielte LC-MS / MS Multiplexverfahren erzeugt. Nach der Auswertung kann der Test der Wirksamkeit von potentiellen Marker der Neurodegeneration zu beurteilen, verwendet werden.
1. Peptid Auswahl und Gestaltung
HINWEIS: Kriterien für einen Marker - Peptid ist , dass es eindeutig sein muss (proteo (quantotypic). Um zu bestimmen, ob ein Peptid eindeutig ist oder nicht, die 'Explosion' Suchwerkzeug auf der Uniprot Website (http://www.uniprot.org/blast/) verwendet werden.
- Definieren Sie eine Liste von Zielproteinen (Marker), dh ApoE (siehe Tabelle 2).
HINWEIS: Wenn die Markierung 8 aus früheren Proteomanalyse Experimenten identifiziert wurde, dann wählen Sie das Peptid, das die beste Antwort von diesem Datensatz gibt. - Wenn diese Informationen nicht verfügbar ist, nutzen Open - Source - Websites, wie in silico Trypsinverdaus von Zielproteinen, ein Software - Tool , wie zB MS-Digest verwenden.
- Wählen Sie das Peptid, das tryptische und nicht anfällig für translationale Modifikationen schreiben.
Hinweis: Diese Informationen finden Sie auf der Website Uniprot www.uniprot.org geprüft werden. Vermeiden Peptide anfällig für chemische Modifikation während LC-MS Probenvorbereitung. <li> die kundenspezifische Synthese der ausgewählten Peptide bestellen.
HINWEIS: Marker-Peptide können benutzerdefinierte von verschiedenen kommerziellen Unternehmen synthetisiert werden. Für ApoE das quantotypic Peptid wurde zur Messung der Gesamt ApoE Ebenen verwendet wird, bestimmt AATVGSLAGQPLQER zu sein. Die proteoPeptidSequenzen verwendet, um die E2 und E4 Varianten bestimmen, sind die tryptischen Peptide zur Position 158 (RLAVYQAGAR und CLAVYQAGAR) und Position 112 (LGADMEDVCGR und LGADMEDVR), respectively.
2. Herstellung des Standard Peptides
HINWEIS: Um die besten quantitative Übergänge zur Auswahl, die Erfassung der Matrix (CSF) muss optimiert werden. Der effizienteste Weg gemultiplexten Peptide optimieren ist Pools der Peptide in bekannten Konzentrationen zu erzeugen. Diese Pools können dann für die Methodenentwicklung und Standardkurven verwendet werden.
- Resuspendieren synthetische Peptide auf 1 mg / ml Stamm (Peptid Details in Tabelle 2 angegeben sind)Konzentration nach Herstelleranweisungen. In der Standardeinstellung , wenn die Anweisungen nicht verfügbar sind , Resuspensierbereich Peptide in 50:50 (v / v) Acetonitril (ACN) / H 2 O.
- Bereiten Sie die 01.10 Verdünnungen des Peptids aus der Stoffkonzentration und Pool 1000 pmol jedes Peptids in eine niedrige Bindungsreaktionsgefäß. Trocknen Sie unten in einem Speed-Vac-Konzentrator die endgültige Pool und bei -20 ° C. Bereiten Sie mehrere Pools für die zukünftige Verwendung.
- Aliquot 100 ul CSF in geringen Bindungs Rohre. Gefriertrocknungs die CSF.
- Resuspendieren eine aliquote Menge von gepoolten 1000 pmol Peptide in Verdauungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 6 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% ASB14) auf Konzentrationen von 10 und 1 pmol / ul erhalten.
- Spike der vereinigten Peptide in den gefriergetrockneten 100 ul Aliquots von CSF bei 0, 1, 2, 5, 10 und 15 pM-Konzentrationen. Hinzufügen, 20 ng von intaktem nicht verwandtes Protein, wie Hefe-Enolase als interner Standard und Kontrolle für die Verdauung Effizienz tr handelnypsin.
- Ganz oben auf der CSF-Aliquots mit Puffer bis zu einer endgültigen Höhe von 20 & mgr; l zu verdauen. Wirbel.
- Hinzufügen, 1,5 ul Dithiothreit (30 mg in 1 ml von 100 mM Tris HCl, pH 7,8) und schüttelt bei Raumtemperatur für 1 Std.
- Hinzufügen 3 ul Iodacetamid (35 mg in 1 ml von 100 mM Tris HCl, pH 7,8) und schüttelt bei Raumtemperatur für 45 min im Dunkeln.
- In 165 ul ddH 2 O.
- In 10 ul 0,1 ug / ul Sequenziergrad modifizierte Trypsin-Lösung in 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer, pH-Wert 7,8. Inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° CO / N und die Verdauung zu stoppen Proben durch Gefrieren. Shop verdaut bei -20 ° C bis bereit zu analysieren.
3. Optimierung von MS Peptiderkennung
- Kopieren Sie die Sequenz des Peptids optimiert werden, in eine entsprechende Software, zB Skyline 9. Klicken Sie auf das Peptidsequenz die Informationen zu erhaltender erwarteten Vorläuferionenmasse und Produkt-Ionen.
- Verdünnen Sie die Peptide von Stammkonzentration weiter auf 1 ng / ml-Konzentration für MS-Methode Entwicklung (siehe Abschnitt 2.1).
- Direkt um die Peptide in dem bei optimierten Strömungsgeschwindigkeit Massenspektrometer ziehen lassen (in der Regel 0,1 bis 0,8 ml / min) und mit 0 - 5% Kollisionsenergie.
- Erwerben Sie MS - Spektrum , um die experimentellen mehrfach geladenen Vorläuferionen 8 zu identifizieren. Wählen Sie den Vorläufer-Ion (m / z), die die meiste Intensität (doubly- oder dreifach geladenen Vorläuferionen wird empfohlen) gibt.
- Reinfundieren das Peptid und anwenden Kollisionsenergie, die das Peptid durch stoßinduzierte Dissoziation (CID) zu fragmentieren. die Kegel und Kollisionsenergien Optimieren Sie die besten Fragmentierungsmuster (Fragmentionen ein- oder zweifach geladen, und die Masse der Fragmentionen vorzugsweise größer als Elternionen, wird empfohlen) zu erhalten.
- Stellen Sie sicher , dass die experimentell ermittelten Übergänge Übergänge in silico erzeugt entsprechen </ Em> (wie in Schritt 3.1 beschrieben). Speichern Sie die Übergangsliste in der MRM-Methode Datei mindestens 2 intensivsten Übergänge pro Vorläuferionen verwendet wird. Fügen Sie zwei Übergänge: 1 für die Quantifizierung und 1 für die Bestätigung im letzten Test.
HINWEIS: Einige MS - Hersteller haben eine Funktion (dh Waters Intellistart) für die automatisierte MRM oder SRM - Analyse - Optimierung. Wenn möglich ziehen lassen Peptide mit kombinierten mobilen Phasen bei 50-70% ACN mit 0,1% FA.
4. LC-MRM-Methodenentwicklung
HINWEIS: Analysieren Sie die Mischung aus synthetischen Peptiden durch eine Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) -System gekoppelt Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. Achten Sie darauf, die Quelle sauber ist. Lösungsmittel A ist ddH 2 0 mit 0,1% FA; Lösungsmittel B wird mit 0,1% FA ACN.
- Verwenden, um die LC-MS-System, ausgestattet mit einem UPLC Säule, die mit C-18-Phase (1,6 & mgr; m Durchmesser, 90 Å Poren, 2,1 mm x 50 mm Länge) und an einer Vorsäule der gleichen Phase. </ Li>
- Defrost CSF verdaut , auf Eis, Zentrifuge bei 16.000 g für 10 Minuten und Transfer 60 ul in 300 ul Glaseinsatz Fläschchen und den Rest bei -20 ° C lagern zurück
- Injizieren Sie die höchste Konzentration von Standardkurve Punkt unter Verwendung von 10 min 1-40% ACN linearen Gradienten (siehe Tabelle 1 für Gradienten - Einstellungen)
- Öffnen Sie das resultierende Chromatogramm und Mitteilungsretentionszeit und oben zwei intensivsten (quantitative) Übergänge pro Peptid alle bestehenden Übergänge in Schritt 3.
- Basierend auf diesen Informationen aktualisieren 10 min MRM - Methode (erstellt in Schritt 3.6) mit zeitlich Kanäle Peptide zu messen (siehe Abbildung 2 für ein Beispiel). Um die Empfindlichkeit beizubehalten, halten jeden Kanal mit Punkten pro Peak größer als 8 und für jedes Peptid Zeit größer als 0,01 sec für mindestens einen Übergang wohnen.
- Fügen Sie "Lösungsmittel Verzögerungen" im MRM-Methode: eine am Anfang, bis 10 Sekunden vor dem ersten Peak der Elution undein anderer am Ende des Verfahrens 20 Sekunden nach dem letzten Peak Elution. Tun Sie dies durch "Lösungsmittel Verzögerungen" in Verfahren Ereignisse in MS-Methode Datei auswählen.
- Führen Sie die Standardkurve durch die MRM Verfahren zeitlich und sicherzustellen, dass es keine störenden unspezifische Spitzen mit Übergängen (erzeugt in Schritt 3.6) von Linearität zu überprüfen.
- Bestimmen Sie, ob die Peptide nachweisbar läuft nicht mit Spikes gepoolten Kontrolle und Krankheit CSF durch die Methode.
- Entfernen der Peptide, die unterhalb der Nachweisgrenze des Assays sind.
Abbildung 2 Beispiel einer dynamischen MRM MS Methode. Timed Kanäle von Peptidübergänge können nach etablierten Retentionszeiten gruppiert werden. Aktivieren MRMs in einer zeitlich abgestimmten Art und Weise eingebracht werden, da die ausgewählten Marker-Peptide aus der Chromatographiesäule eluieren, minimiert die Anzahl der transitions über einen Zeitraum und erhöht die Empfindlichkeit des Tests. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Die Zugabe von internen Standards
HINWEIS: Wie bereits 10, stabilen isotopenmarkierten internen Standards beschrieben sind, können in dem Assay eingeschlossen werden. Aufgrund der Kosten dieser Standards, ist es ratsam, zuerst die Peptide in der Matrix zu bewerten.
- Bestimmen Sie die ideale Peptide zur Erkennung in CSF optimiert: Wählen Sie die Peptide, die die wiederkehrenden sind, mit der höchsten Intensität und ohne Störspitzen.
- Design - Peptide entsprechend schwere 13 C 15 N Aminosäure - Etiketten enthalten, die die Masse des Peptids durch mindestens 6 Da in Bezug auf endogene Peptid erhöhen. Fügen Sie außerdem ein Tag von 4 - 6 zusätzliche Aminosäuren entweder an den N- oder C-Terminus der schweren peptide für tryptische Verdauung zu steuern.
- Verdünnen stabilen isotopenmarkierten internen Standards in Verdauungspuffer (siehe Schritt 2.4). Bestimmen Sie die ideale Menge an stabilen Isotopen-markierten internen Standard, der in CSF versetzt werden, indem in verschiedenen Ebenen Spick in Abhängigkeit von den Abundanzen zuvor während der Entwicklung beobachtet. Ziel ist etwa 1 zu erreichen: 1-Verhältnis von stabilen isotopenmarkierten Standard endogene Peptid.
HINWEIS: Stabil isotopenmarkierten internen Standards kann durch verschiedene Handelsgesellschaften synthetisiert werden.
6. LC-MRM-Test der CSF Patientenproben
- Spike optimierte Menge von stabilen isotopenmarkierten Standards in 100 ul CSF und gefrier trocknen Sie die Mischung.
- Resuspendieren CSF in 20 ul-Digest-Puffer und die Verdauung durchführen wie in den Punkten beschrieben 2,7-2,10.
- Analysieren Sie die Proben LC-MRM-Methode in Schritt entwickelt unter Verwendung von 4.
- Für die quantitative Analyse, führen Sie den Standard-pepEbbe und Flut in Konzentrationen von 0 -15 pmol in einer Standardkurve. Siehe Schritt 2.5 zur Herstellung von Standardkurve.
7. Datenanalyse
HINWEIS: Quantitative Daten basiert auf dem Intensitätsverhältnis von Basisspitzen internen Standards (schwere markierte Peptide). Detaillierte Informationen zu SRM / MRM Datenanalyse wurde zuvor beschrieben 10. Verhältnisdaten können dann in einer Standardkurve verwendet werden absolute Ebenen zu bestimmen oder sie von der zusätzlichen Konzentration an Schwer-markiertem Peptid berechnen.
- Analysieren LC-MRM Daten der Massenspektrometern Hersteller Standardsoftware 10 verwendet wird . Alternativ können Sie Skyline Software 10 quantitative MRM Daten zu analysieren.
- Überprüfen Sie die Empfindlichkeit des Laufs durch die Reaktion eines internen Standards überprüft, wie die Stachel Hefe Enolase oder einem stabilen isotopenmarkierten Standard in jedem Lauf. Sicherzustellen, dass der Variationskoeffizient (CV) nicht größer ist als25%.
- Sie manuell die Daten Anmerkung überprüfen Genauigkeit zu gewährleisten. Analysieren jedes Peptid und das Verhältnis zu einem geeigneten stabilen isotopenmarkierten internen Standards, das heißt, verwenden Sie das stabile Isotop-markierte Version des Peptids , falls verfügbar.
- Zur Erzielung absoluten Werte von pmol pro 100 ul CSF, führen Sie das Verhältnisdaten durch geeignete Standardkurven, die zur gleichen Zeit ausgeführt wurden.
- Berechnen der Variationskoeffizient (CV). CV für jedes Peptid sollte unter 25% und unter 15% für hohe reichlich Peptide sein.
HINWEIS: Absolutwert pmol pro 100 ul CSF-Werte können in den nachfolgenden Downstream statistische Analyse verwendet.
8. Apolipoprotein E Isoform-Status
HINWEIS: ApoE Isoform-Status zu bestimmen, kann die Anwesenheit der entsprechenden Peptide durch die Bestimmung der Anwesenheit jeder Isoform durchgeführt werden.
- Betrachten Sie die ApoE in 100 ul CSF Schwelle von> 1.000 Signal-zu-Rauschen als positiv für das Peptid. Siehe Abbildung 5 für die Peptide erforderlich / abwesend eines Patienten Isoform - Status zu bestimmen. Bestimmen Sie die Allel-Expression durch die% jeder Isoform Berechnung ApoE-Expression insgesamt.
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Representative Results
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens, ein hoher Durchsatz 10 min Multiplex - Assay bestehend aus 74 Peptiden , die aus 54 - Proteine entwickelt wurde, als ein Assay für Marker der neurodegenerative Erkrankungen Alzheimer-Krankheit und Lewy - Körperchen - Demenz (LBD) 8. 3 zeigt eine Multiplex - Chromatogramm erschienen zuvor 8 der signifikanten Peptidmarker aus dem Assay. Die Peptide in dem Assay und deren quantitative Übergänge enthalten sind , in Tabelle 2 angegeben. Die durch dieses Verfahren erzeugten Daten gibt standardisierte Verhältnisse der jeweiligen stabilen isotopenmarkierten internen Standards. Diese Werte können dann durch eine Standardkurve gesetzt werden, um absolute pmol / 100 ul CSF-Konzentrationen zu bestimmen. Diese Werte können dann statistisch werden für Änderungen in klinischen Proben analysiert.
Wie zuvor beschrieben , 8, Quantifizierung der 74 peptides in diesem CSF Test aufgenommen ergab, dass 25 dieser Marker signifikant im Liquor von Demenzpatienten verändert wurden. Um die Wirksamkeit dieses Tests veranschaulichen die Ergebnisse von zuvor beschriebenen Demenz Marker Pro-Orexin und YKL Chitinase 3-ähnliches Protein (YKL-40) , 11,12 sind in Figur 4 angegeben. Der integrierte ApoE - Assay identifiziert die ApoE - Isoform / Allel Status der Patient als auch. Apo E4 ist ein bekannter Risikofaktor für die Alzheimer-Krankheit, daher ist diese in den Test zu integrieren wertvolle Informationen liefern. Die Detektion der ApoE - Isoformen ist in 5 erläutert und wird für Isoformen E2 (R158C) und E4 (C112R) auf dem Nachweis der entsprechenden Peptide für die Aminosäureänderungen basieren. 5A zeigt die Peak - Muster für jede Isoform Kombination erwartet und 5B zeigt das Ergebnis eines CSF mit dem Assay auf Patientenproben getestet.
Abbildung 3. Repräsentative Overlaid MRM Chromatogramme. Reprint von Heywood et al. 8 Biomarkers Bedeutung für die neurodegenerativen Erkrankungen Lewy - Körperchen - Demenz und der Alzheimer - Krankheit 8 werden über einen 10 - min LC Gradient gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Beispieldaten. Sonderdruck aus Heywood et al. 8 Diagramme zeigen , wie die beschriebene MRM LC-MS / MS - Verfahren können von den Kontrollen die bekannten neurodegenerative Marker wie YKL Chitinase 3-ähnliches Protein (YKL-40) , 11 zuverlässig zu quantifizieren und zu unterscheiden , 12 und die AD - Marker Pr o-Orexin 13. AD = Alzheimer-Krankheit, LBD = Lewy-Körperchen-Demenz und PD = Parkinson-Krankheit. Daten vorher veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Abbildung Wie das Apo E Isoform Status eines Patienten bestimmt werden. A. Zeigt die Peptide für den 112 Aminosäuresequenz LGADMEDVCGR für neutral (E3a) oder LGADMEDVR auf das Vorhandensein von E4 und für die Position 158 RLAVYQAGAR die neutral zu erkennen (E3b) oder CLAVYQAGAR für die E2 - Isoform. B. Peptide , die aus der ApoE - Sequenz sind in der linken Tafel gezeigt. Die verschiedenen Kombinationen der Peptide in der CSF festgestellt kann die ApoE Isoform Status anzeigen.files / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Zeit | Fluss (ml / min) | % EIN | % B | Kurve |
| Initiale | 0,8 | 97 | 3 | Initiale |
| 0,2 | 0,8 | 97 | 3 | 6 |
| 0,8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7.01 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8.01 | 0,8 | 97 | 3 | 1 |
| 10 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Tabelle 1. UPLC Gradient - Einstellungen für eine 10 min Methode. A = ddH 2 0 0,1% FA, B ACN = 0,1% FA
Tabelle 2. Peptide enthalten im Liquor MRM LC MS / MS - Assay. Dargestellt sind alle enthalten Peptide , die in dem Verfahren verwendet werden, die beschrieben und 8 veröffentlicht. Angabe, ob der Marker zuverlässig in 100 ul CSF festgestellt wurde, wird angezeigt. Transitions in fett markiert sind diejenigen , für die quantitative Daten verwendet. Bitte hier klicken , um diese Tabelle zum Download bereit .
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Discussion
Wie bei allen MS basierenden Assays sind die kritischen Schritte in dem Verfahren der Bestimmung der geeigneten und genauen Mengen von internen Standards. Wenn absolute Quantifizierung verwendet wird, dann sind die richtigen Mengen an Stachel Peptide in der Standardkurve sind ebenfalls entscheidend.
Unser Test erfordert nicht die Fällung des CSF oder die Verwendung von jeder Art von Sanierung oder Entsalzen Schritte vor der MS-Analyse - es ist eine völlig Eintopfreaktion Verfahren. Aufgrund des geringen Volumens von CSF und seiner begrenzten Komplexität (im Vergleich zu Plasma), wurde gefunden, dass diese Schritte aus dem endgültigen Protokoll entfernt werden kann, wodurch der Assay vereinfacht und es besser geeignet für die Übersetzung in diagnostischen Einstellung vornehmen. Die Einschlüsse einer Vorsäule zum Haupt analytischen Säule und der Lösungsmittel Verzögerungen bei der MS-Methode erscheinen ausreichend, um die Empfindlichkeit um mehr als 500 Proben durchgeführt während der MS zu erhalten. Da der Assay-UPLC running Zeit ist kurz, ist es wichtig, eindeutig die richtige Spitze in der CSF verdauen Matrix identifizieren.
Dies kann nur mit der Verwendung von spiked synthetisierten Peptide und einer Standardkurve erreicht werden. Wenn es eine Unsicherheit von einem auf den richtigen chromatographischen Peak abgestimmt Peptid ist, dann kann es sinnvoll sein, um die Probe durch mehrere Übergänge und überprüfen Sie die Übergänge Intensitätsmuster mit den synthetischen Standards zu laufen. Alle unsere Tests enthalten mindestens zwei Peptide Übergänge, die Identität des Peptids zu bestätigen.
Der Test wurde für Marker erfasst bis zu 100 & mgr; l CSF entwickelt. Für einige andere Marker von Demenz kann ein größeres Volumen an CSF benötigt. Eine weitere Einschränkung des Assays ist die Frage der Dynamikbereich der Proteinexpression. Einige reichlich Marker müssen auf dem Massenspektrometer in einem kleineren Mengen injiziert werden, während einige niedrige reichlich Marker eine größere Injektionsvolumina erfordern. Deshalb ist die sample kann zweimal injiziert werden müssen.
Die Bedeutung dieser Technik ist die Fähigkeit, zu multiplexen und die erhöhte Spezifität der 3 Stufen der Identifizierung über Antikörper (Retentionszeit, Vorläufer und Produkt m / z). Aus der Sicht der klinischen Übersetzung, der größte Vorteil ist die potentiellen Kosten auf Antikörpern zu speichern, wenn eine anfängliche Aufwand für die Massenspektrometrie Ausrüstung und geschultes Personal erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil ist die Geschwindigkeit, in der das Verfahren kann auf die Triple-Quadrupol-basierten Systemen translatiert werden. Dies beschleunigt erheblich die Fähigkeit eines Tests im Vergleich zu allen Immun-basierte Techniken zu übersetzen und zu validieren. Schließlich ist, wie diese Plattform und Know-how hat routinemäßig kleine Moleküle verwendet worden zu messen klinisch, haben viele große Krankenhauszentren bereits diese Infrastruktur. Auf dem Gebiet der Neurodegeneration gibt es eine Menge Fokus und Notwendigkeit neuer Biomarker im Liquor und Serum. Dieses Verfahren stellt eine plaTForm für einen Assay mit hohem Durchsatz , wo zukünftige Marker hinzugefügt werden kann (und entfernt) zur Wirksamkeit bewertet werden, usw. Diese Technik hat weitere Anwendung auf andere Gewebe für ApoE Isoform Identifizierung, wie beispielsweise Plasma , die bereits 2 und sogar Blutspots beschrieben wurde.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V.
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
