Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
Honden worden gebruikt als grote diermodel voor cardiovasculaire ziekte onderzoek en kan ook last hebben van aangeboren (genetische) vasculaire abnormaliteiten 1, 2. Om deze ziekten commerciële endotheliale cellijnen worden vaak gebruikt om endotheelcellen (EC) functionaliteit beoordelen bestuderen. Voor honden is er een commercieel endotheliale cellijn beschikbaar (CnAOEC), afkomstig van honden aorta. Deze cellijn wordt meestal gebruikt in studies als controle normale EC 3-5. In menselijke cardiovasculair onderzoek het meest gebruikte endotheliale cellijnen humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en Human Umbilical Artery endotheelcellen (HUAECs) afgeleid van menselijke navelstreng ader en slagader, respectievelijk. HUVEC's werden gebruikt als de gouden standaard voor vasculaire onderzoek sinds 1980 6. Zij worden beschouwd als de klassieke modelsysteem endotheelfunctie en aanpassing ziekte bestuderen. Endotheelcellen geïsoleerd uit verschillende bloedvaten variëren appearance en functionaliteit door genetische achtergrond en blootstelling aan de micro-7. Bovendien, HUVEC en HUAECs zijn afgeleid van navelstreng, een ontwikkelings vasculaire structuur die misschien niet volledig nabootsen volwassen bloedvaten met betrekking tot de voorwaarden die worden blootgesteld en respons op disease. Vandaar dat het vertalen van de resultaten gevonden in HUVECs en HUAECs aan hart- en vaatziekten in het algemeen onvoldoende is.
Bij het bestuderen aanpassing en gedrag van volwassen EC moet primaire EC uit het vat plaats worden gebruikt als een directere aanpak. Om deze cellen te isoleren, zijn verscheidene werkwijzen gerapporteerd. Een veel beschreven werkwijze, die ook wordt gebruikt voor HUVEC, wordt het vat spoelen met een enzymatische digestieoplossing 8. Dit resulteert vaak verontreinigd met niet-ECs zoals gladde spiercellen en fibroblasten 9. Een andere veel gebruikte werkwijze voor isolatie enzymatische digestie van gehakt vaatweefsel gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) op basis van endotheelcellen marker Cluster van Differentiatie (CD) 31 7, 8. FACS sortering en daaropvolgende celcultuur vereist relatief veel cellen en is daarom niet geschikt voor het isoleren van endotheel van kleine bloedvaten. Wij zijn dan ook gericht op het ontwikkelen van een nieuwe robuuste methode voor het isoleren van een zuivere endotheelcellen bevolking uit verschillende honden bloedvaten met een hoge zuiverheid. Om de efficiëntie van de nieuwe isolatiewerkwijze testen we geïsoleerd en verkregen zuivere Canine Primaire endotheelcellen (CAPEC) kweken van verschillende honden slagaders en aders, zowel grote als kleine. Deze methode maakt het ook mogelijk de cultuur van endotheelcellen afkomstig van zieke en / of afwijkende schepen zoals aangeboren intra- of extra-lever portosystemische shunts, een veel voorkomende ziekte bij honden 2. De werkwijze maakt de isolatie van aanvullende relevante celtypes van hetzelfde vat zoals vasculaire gladde spiercellen aangezien de meeste van het vaartuig blijft intoptreden tijdens de procedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
In studies gericht op honden EC de primaire lijn CnAOEC wordt gebruikt om de endotheliale lijnen van de hond 3, 12, 13 te modelleren. In humane studies, is de HUVEC cultuur nog steeds beschouwd als de gouden standaard. Het is duidelijk dat, met de nadruk alleen op de EC afkomstig uit de navelstreng is een stevige beperking in de cardiovasculaire onderzoek. Endotheelcellen een genexpressie patroon bepalen arterioveneuze specificatie. Om rekening houden met deze verschillen in postnatale vaartuigen stellen wij …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
