犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
イヌは、心血管疾患の研究のための大型動物モデルとして使用され、また先天性（遺伝的）血管異常1,2苦しむことができる。商業内皮細胞株は、しばしば、内皮細胞（EC）の機能を評価するために使用されるこれらの疾患を研究します。犬のための犬の大動脈由来（CnAOEC）利用可能な1の市販の内皮細胞株は、そこにあります。この細胞株は、主制御通常のEC 3-5として研究に使用されています。人間の心血管研究では、最も一般的に使用される内皮細胞株は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAECs）は、それぞれ、ヒト臍帯静脈と動脈由来。 HUVECを、1980 6以降血管研究の黄金の標準として使用されてきました。これらは、内皮機能および疾患の適応を研究するための古典的なモデル系であると考えられます。異なる血管から単離された内皮細胞は、appearancで変化します遺伝的背景と微小環境7への曝露に起因する電子と機能。また、HUVECをとHUAECsは、臍帯からの条件に関して完全に模倣大人の血管が、彼らはにし、病気への応答さらされていない可能性があり、発達血管構造を導出しています。したがって、一般的には、心血管疾患にHUVECを中に見出された結果とHUAECsを翻訳することは不適切です。
大人ECの適応と行動を研究すると、関心の容器からの一次のECは、より直接的なアプローチとして使用されるべきです。これらの細胞を単離するために、いくつかの方法が報告されています。また、HUVECをするために使用され、広く記載された方法は、酵素消化液8と容器をフラッシュします。これは、多くの場合、平滑筋細胞および線維芽細胞9のような非電気部品の混入をもたらします。分離のためのもう一つの頻繁に使用される方法は、蛍光に続いみじん切り血管組織の酵素消化であります分化（CD）31 7、8。FACSソーティングの内皮細胞マーカーのクラスタとそれに続く細胞培養に基づいて選別（FACS）活性化細胞は、細胞を比較的大量に必要とし、したがって小血管からの内皮細胞の単離に適していません。したがって、我々は、高純度で、様々なイヌの血管から純粋な内皮細胞集団を単離するための新しい堅牢な方法を開発することを目的としました。新しい分離方法の効率を試験するために、我々は、単離され、大小異なるイヌの動脈と静脈からの純粋な犬の初代内皮細胞（CaPEC）の文化を、取得しました。この方法はまた、先天性細胞内または肝外門脈体循環シャント、犬2で共通の疾患などの罹患および/または異常な血管由来の内皮細胞の培養を可能にします。血管の大部分は整数のままための方法は、血管平滑筋細胞と同様の容器の追加の関連する細胞型の単離を可能にします手順の間に行動します。
Protocol
Representative Results
Discussion
イヌのECに焦点を当てた研究ではCnAOECプライマリラインは犬3、12、13の内皮系統をモデル化するために使用されている。ヒトの研究では、HUVECの文化は、まだゴールドスタンダードと考えられています。明らかに、臍帯由来のECに単に焦点を当てすることは、心血管研究の会社制限があります。内皮細胞は、静脈の仕様を決定する特定の遺伝子の発現パターンを有します。出生後の血管…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
