Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
Köpekler kardiyovasküler hastalık araştırmaları için büyük bir hayvan modeli olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda doğuştan (genetik) vasküler anormallikler 1, 2 muzdarip olabilir. Ticari endotel hücre hatları genellikle endotel hücre (EC) işlevselliğini değerlendirmek için kullanılan bu hastalıkların incelenmesi. köpekler için köpek aortundan alınan (CnAOEC) mevcuttur ticari bir endotelyal hücre hattı vardır. Bu hücre hattı çoğunlukla kontrol, normal EC 3-5 olarak çalışmalarda kullanılmaktadır. kan dolaşım araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücre çizgileri sırasıyla insan göbek kordonu damar ve arter türetilen insan Göbek Daman Endotel Hücreleri (HUVECs) ve İnsan Umbilikal Arter Endotel Hücreleri (HUAECs) vardır. HUVECler 1980'lerden 6 yılından bu yana damar araştırmalarda altın standart olarak kullanılmıştır. Onlar endotel fonksiyonu ve hastalık adaptasyonunu incelemek için klasik model sistem olarak kabul edilmektedir. Farklı kan damarları izole endotel hücreleri appearanc değişirE ve mikroçevresinin 7 genetik arka plan ve maruz kalma nedeniyle işlevsellik. Buna ek olarak, HUVECler ve HUAECs, göbek kordonu şartlarına göre tamamen taklit yetişkin kan damarlarının onlar ve hastalığa yanıt maruz olmayabilir gelişimsel vasküler yapı elde edilir. Bu nedenle, genel olarak kardiyovasküler hastalık için HUVEC bulunan sonuçları ve HUAECs tercüme yetersizdir.
adaptasyon ve yetişkin EC davranışını incelerken, ilgilenilen damarın birincil EC daha doğrudan bir yaklaşım olarak kullanılmalıdır. bu hücrelerin izole edilmesi için, çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Ayrıca, HUVEC için kullanılan bir çok tarif edilen yöntem, enzimatik sindirim çözeltisi 8 kap yıkama edilir. Bu çoğu zaman, düz kas hücreleri, fibroblastlar ve 9 olmayan EC ile kontaminasyon sonuçlanır. izolasyon için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, Floresan-takiben kıyılmış damar doku enzimatik sindirimi olanFarklılaşma (CD) 31 7, 8. FACS ayıklama endotelyal hücre belirteci küme ve daha sonra, hücre kültürü göre (FACS) aktif hücre hücrelerin nispeten büyük miktarlarda gerektirir ve bu nedenle ince kan damarlarından endotelyumun izolasyon için uygun değildir. Bu nedenle yüksek saflıkta çeşitli köpek kan damarlarından saf endotel hücre popülasyonunu izole etmek için yeni bir sağlam bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. Yeni izolasyon yönteminin etkinliğini test etmek için, izole ve büyük ve küçük her ikisi de farklı köpek arterler ve venler, saf Canine Primer endotel hücre (CapeC) kültürleri elde etti. Bu yöntem aynı zamanda doğuştan içi veya dışı hepatik portosistemik şant, köpekler 2 ortak bir hastalık olarak hastalıklı ve / veya anormal damarlardan kaynaklanan endotel hücrelerinin kültürü sağlar. kabın en int olarak kalmaktadır, bu yöntem, vasküler düz kas hücreleri gibi aynı geminin alakalı ek hücre tiplerinin izolasyonu sağlarİşlem sırasında hareket ederler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Köpek EC odaklanan çalışmalarda CnAOEC birincil hat köpek 3, 12, 13 endotel soy modellemek için kullanılır. İnsan çalışmalarında, HUVEC kültürü hala altın standart olarak kabul edilmektedir. Açıkçası, göbek kordonu elde edilen EC üzerinde sadece odaklanan Kardiyovasküler araştırmalarda bir firma kısıtlama olduğunu. Endotel hücreleri arteriovenöz özelliklerinin belirlenmesiyle belirli bir gen ifade desen var. Doğum sonrası damarlarda bu farklılıkların hesaba katmak için bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
