Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Summary

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Abstract

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introduction

Los perros se utilizan como gran modelo animal para la investigación de enfermedades cardiovasculares y también pueden sufrir de anomalías congénitas vasculares (genéticos) ^{1, 2.} Para estudiar estas enfermedades líneas de células endoteliales comerciales a menudo se utilizan para evaluar la funcionalidad de las células endoteliales (CE). Para los perros hay una línea de células endoteliales comercial disponible (CnAOEC), derivado de la aorta canino. Esta línea celular se utiliza sobre todo en los estudios como el control normal de los EC ^3-5. En la investigación cardiovascular humano las líneas de células endoteliales más comúnmente utilizadas son células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) y de la arteria umbilical humana Las células endoteliales (HUAECs) derivadas de la vena umbilical humana espinal y la arteria, respectivamente. HUVECs se han utilizado como el estándar de oro en la investigación vascular desde la década de 1980 ^6. Ellos son considerados como el sistema clásico modelo para estudiar la función endotelial y la adaptación de la enfermedad. Las células endoteliales aisladas de diferentes vasos sanguíneos varían en appearance y funcionalidad debido a antecedentes genéticos y la exposición al microentorno ^7. Además, HUVECs y HUAECs se derivan de cordón umbilical, una estructura vascular del desarrollo que no pueden vasos sanguíneos adulto completamente imitan con respecto a las condiciones que se exponen a y la respuesta a la enfermedad. Por lo tanto, la traducción de los resultados encontrados en las HUVEC y HUAECs de enfermedades cardiovasculares en general es insuficiente.

Cuando se estudia la adaptación y comportamiento de los adultos EC, EC primarias del vaso de interés deben utilizarse como un enfoque más directo. Para aislar estas células, se han descrito varios métodos. Un método ampliamente descrito, que también se utiliza para HUVECs, está vaciando el recipiente con una solución de digestión enzimática ^8. Esto a menudo resulta en la contaminación con no ECs tales como las células de músculo liso y fibroblastos ^9. Otro método utilizado frecuentemente para el aislamiento es la digestión enzimática de tejido de vasos picada seguido de por fluorescenciade células activadas (FACS) basado en Cluster marcador de células endoteliales de diferenciación (CD) 31 ^{7, 8.} FACS clasificación y cultivo celular posterior requiere cantidades relativamente grandes de las células y por lo tanto no es adecuado para el aislamiento de endotelio de los vasos sanguíneos pequeños. Por lo tanto, el objetivo fue desarrollar un nuevo método robusto para aislar una población pura de células endoteliales de diversos vasos sanguíneos caninos con alta pureza. Para probar la eficacia del nuevo método de aislamiento, se aislaron y se obtuvieron cultivos puros Canine primaria de células endoteliales (CAPEC) de diferentes arterias y venas canino, tanto grandes como pequeñas. Este método también permite que el cultivo de células endoteliales procedentes de enfermo y / o vasos aberrantes tales como derivaciones portosistémicas intra o extra-hepáticos congénitos, una enfermedad común en los perros ^2. El método permite el aislamiento de tipos de células relevantes adicionales de la misma embarcación, tales como células de músculo liso vascular ya que la mayoría de la embarcación permanece intactuar durante el procedimiento.

Protocol

Ética declaración: Los vasos sanguíneos utilizados en este estudio fueron cosechadas como material excedente obtenido a partir de cadáveres caninos frescas (n = 4) de los perros sanos sacrificados para otras investigaciones no relacionado (política de la Universidad 3R). vasos sanguíneos anormales (derivación portosistémica intra y extrahepáticas, n = 1 cada uno) fueron cosechadas después de la muerte tras el consentimiento informado de los propietarios de los perros presentados a la Clínica Universitaria de …

Representative Results

Diferentes vasos sanguíneos se sometieron con éxito para el protocolo de aislamiento descrito (Figura 2). Fue posible diseccionar e invierta aorta, vena cava, la vena porta y la arteria coronaria de perros sanos (todos los buques de cada perro, n = 4). Con los mismos ECs de aproximación se aislaron a partir de dos derivación portosistémica congénita (extrahepática y intrahepática, n = 1 cada uno). Aunque aorta se invierte fácilmente, los segmentos de aorta torá…

Discussion

En los estudios que se centran en los EC canina de la línea primaria CnAOEC se utiliza para modelar los linajes endoteliales del perro ^{3, 12, 13.} En estudios en humanos, la cultura HUVEC todavía se considera el estándar de oro. Claramente, centrándose simplemente en ECs derivadas de cordón umbilical es una restricción firme en la investigación cardiovascular. Las células endoteliales tienen un patrón de expresión de genes específicos para determinar la especificación arteriovenosa. Con el fin de d…

Materials

Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176