Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
Собаки используются в качестве большой животной модели для исследования сердечно – сосудистых заболеваний , а также может страдать от врожденных (генетических) сосудистых аномалий 1, 2. Для изучения этих болезней коммерческие клеточные линии эндотелиальные часто используются для оценки эндотелиальных клеток (EC) функциональные возможности . Для собак есть одна коммерческая линия эндотелиальные клетки доступны (CnAOEC), полученный из собачьей аорты. Эта клеточная линия в основном используется в исследованиях в качестве контроля нормального Écs 3-5. В исследовании сердечно-сосудистой системы человека наиболее часто используемые клеточные линии эндотелиальные являются пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) и человеческого пупочной артерии эндотелиальных клеток (HUAECs), полученные из пупочной вены человека мозга и артерии, соответственно. HUVECs были использованы в качестве золотого стандарта в сосудистых исследований с 1980 года 6. Они считаются классическая модель системы для изучения эндотелиальной функции и адаптации к болезни. Эндотелиальные клетки, выделенные из различных кровеносных сосудов варьируются в appearancе и функциональные возможности из – за генетического фона и воздействия микросреды 7. Кроме того, HUVECs и HUAECs получают из пуповины, а с развитием сосудистой структуры, которая, возможно, не в полной мере имитируют взрослых кровеносные сосуды, в отношении условий, которым они подвергаются, и реакция на болезнь. Следовательно, перевод результатов поиска в HUVECs и HUAECs сердечно-сосудистых заболеваний в целом является недостаточным.
При изучении адаптации и поведение взрослых КЭ, первичные КЭ из емкости интереса следует использовать в качестве более прямой подход. Для того, чтобы изолировать эти клетки, были зарегистрированы несколько методов. Широко описан метод, который также используется для HUVECs, является промывка сосуда с раствором ферментативного расщепления 8. Это часто приводит к загрязнению с не КЭ , таких как клетки гладких мышц и фибробластов 9. Другим часто используемым способом выделения является ферментативное переваривание измельченной ткани сосуда с последующим флуоресцентные-Активированный сортировки клеток (FACS) на основе эндотелиального клеточного маркера кластер дифференцировки (CD) 31 7, 8. FACS сортировочного и последующей клеточной культуры , требует относительно больших количеств клеток , и поэтому не подходит для выделения эндотелием из мелких кровеносных сосудов. Поэтому мы нацелены на разработку нового надежного способа выделения чистого эндотелиальной популяции клеток из различных собачьих кровеносных сосудов с высокой степенью чистоты. Для того, чтобы проверить эффективность нового метода изоляции, мы выделили и получили чистые Собачий Первичные эндотелиальные клетки (ЦАТЭК) культуры из различных собачьих артерий и вен, как больших, так и малых. Этот метод также позволяет культуре эндотелиальных клеток , происходящих из больных и / или аберрантных сосудов , таких как врожденными интра- или экстра-печеночной портосистемных шунтов, распространенное заболевание у собак 2. Метод позволяет выделение дополнительных соответствующих типов клеток одного и того же сосуда, таких как гладкомышечные клетки сосудов, так как большая часть сосуда остается ИНТдействовать во время процедуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
В исследованиях , посвященных собачьего КЭ основной линии CnAOEC используется для моделирования эндотелиальные родословных собаки 3, 12, 13. В исследованиях на людях, культуре HUVEC по – прежнему считается золотым стандартом. Очевидно, ориентируясь только на КЧС, полученных из пуповины я?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
