Biosensing Motor Neuron Membran Potensial i Live Zebrafish Embryoer
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
In vivo systemisk komponentanalyse tillater forskere å undersøke cellulær oppførsel på den mest pålitelige måten. Dette gjelder særlig når aktiviteten under kontroll er sterkt påvirket av celle-celle-interaksjoner (både kontakt- og ikke-berøringsavhengig), som i nervesystemet, hvor membranspenningsendringer driver kommunikasjonen mellom spennende celler. Forståelsen av informasjonen som kodes av disse elektriske signaler er nøkkelen til å forstå hvordan nervesystemet virker i både fysiologiske og sykdomstilstander.
For å studere celle elektriske egenskaper i de mest ikke-invasive fysiologiske forholdene, er flere genetisk kodede spenningsindikatorer nylig utviklet 1 . I motsetning til tidligere generasjoner av optiske spenningssensorer (hovedsakelig spenningsfølsomme farger) 2 , tillater GEVIs in vivo analyser av det intakte nevrale systemet, ogDeres uttrykk kan begrenses til bestemte celletyper eller populasjoner.
Zebrafish-embryoet er valget av in vivo "substrat" for å dra nytte av det store potensialet som tilskrives GEVIs. Faktisk, takket være den optiske klarheten og det forenklede, men evolusjonært konserverte nervesystemet, tillater sebrafiskmodellen enkel identifisering og manipulering av hver mobilkomponent i et nettverk. Faktisk har ansettelsen av den FRET-baserte GEVI Mermaid 3 ført til identifisering av pre-symptomatiske endringer i spinalmotor-neuronadferd i en sebrafiskmodell av amyotrofisk lateralsklerose (ALS) 4 .
Følgende in vivo- protokoll beskriver hvordan man overvåker de elektriske egenskapene til spinalmotorneuroner i intakte zebrafiskembryoer som uttrykker havfrue på en nevron-spesifikk måte. Videre demonstrerer det hvordan farmakologisk indusert chanGes i slike elektriske egenskaper kan være forbundet med endringer i hyppigheten av embryonale spontane spoler, den stereotypiske motoraktiviteten som karakteriserer bevegelsesadferden til sebrafisken i svært tidlige utviklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presentert her tillot oss å undersøke sammenhengen mellom de elektriske egenskapene til sebrafisk-embryo-spinalmotorneuroner og den spontane spiralbehandlingen, den tidligste stereotypiske motoraktiviteten, som fremgår rundt 17 hkf av embryonisk utvikling og varer til 24 hkf 10 .
Vår tilnærming gir forskere et verktøy for å studere nevrale systemet av intakte embryoer, og fullt ut bevare kompleksiteten av samspillet mellom celler i et utviklende fun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
