Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
In-vivo- systemische Komponentenanalyse ermöglicht es Wissenschaftlern, zelluläres Verhalten auf die zuverlässigste Weise zu untersuchen. Dies trifft besonders dann zu, wenn die zu prüfende Aktivität stark durch Zell-Zell-Wechselwirkungen (sowohl kontakt- als auch berührungsabhängig) beeinflusst wird, wie im Nervensystem, wo Membranspannungsänderungen die Kommunikation zwischen erregbaren Zellen antreiben. Das Verständnis der Informationen, die von diesen elektrischen Signalen codiert werden, ist der Schlüssel zum Verständnis der Art und Weise, wie das Nervensystem sowohl in physiologischen als auch in Krankheitszuständen arbeitet.
Um zelle elektrische Eigenschaften in den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen zu untersuchen, wurden vor kurzem mehrere genetisch codierte Spannungsindikatoren entwickelt 1 . Im Gegensatz zu den bisherigen Generationen von optischen Spannungssensoren (hauptsächlich spannungsempfindlichen Farbstoffen) 2 erlauben GEVIs in vivo Analysen des intakten neuronalen Systems undIhre Expression kann auf bestimmte Zelltypen oder Populationen beschränkt sein.
Der Zebrafisch-Embryo ist der in vivo "Substrat" der Wahl, um das große Potenzial zu nutzen, das GEVIs zugeschrieben wird. Tatsächlich ermöglicht das Zebrafisch-Modell dank seiner optischen Klarheit und seines vereinfachten, aber dennoch evolutionär konservierten Nervensystems die einfache Identifikation und Manipulation jeder zellularen Komponente in einem Netzwerk. In der Tat führte die Beschäftigung der FRET-basierten GEVI Mermaid 3 zur Identifizierung von prä-symptomatischen Veränderungen im Wirbelsäulenmotor-Neuron-Verhalten in einem Zebrafisch-Modell der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) 4 .
Das folgende in vivo- Protokoll beschreibt, wie die elektrischen Eigenschaften von Wirbelsäulenmotor-Neuronen in intakten Zebrafisch-Embryonen, die Meerjungfrau in einer neuronalspezifischen Weise exprimieren, überwacht werden. Darüber hinaus zeigt es, wie pharmakologisch induzierte chanGes in solchen elektrischen Eigenschaften können mit Veränderungen in der Häufigkeit der embryonalen Spontanspulen verbunden sein, die stereotypische motorische Aktivität, die das Bewegungsverhalten des Zebrafischs in sehr frühen Entwicklungsstadien charakterisiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Protokoll erlaubte es uns, die Assoziation zwischen den elektrischen Eigenschaften von Zebrafisch-Embryo-Wirbelsäulenmotor-Neuronen und dem spontanen Wickelverhalten zu erforschen, die früheste stereotypische motorische Aktivität, die um 17 hpf der embryonalen Entwicklung auftritt und bis 24 hpf 10 dauert.
Unser Ansatz bietet Forschern ein Werkzeug, um das neuronale System der intakten Embryonen zu studieren, wobei die Komplexität der Wechsel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
