Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
ב vivo ניתוח מרכיב מערכתית מאפשרת למדענים לחקור התנהגות הסלולר בצורה האמינה ביותר. הדבר נכון במיוחד כאשר הפעילות הנבדקת מושפעת במידה רבה מהאינטראקציות של תאי-התא (הן מגע והן ללא קשר), כמו במערכת העצבים, שבה שינויים בממברנה יוצרים את התקשורת בין תאים נרגשים. הבנת המידע המקודד על ידי אותות חשמליים אלה היא המפתח להבנת האופן שבו פועלת מערכת העצבים במצבים פיזיולוגיים ומחלות כאחד.
על מנת ללמוד תכונות חשמליות התא בתנאים פיזיולוגיים לא פולשנית ביותר, כמה אינדיקטורים מתח מקודד גנטית פותחו לאחרונה 1 . בניגוד לדורות הקודמים של חיישני מתח אופטי (בעיקר צבעים רגישים למתח) 2 , GEVIs מאפשרים ניתוחי vivo של מערכת העצבים השלמה,הביטוי שלהם יכול להיות מוגבל סוגי תאים ספציפיים או אוכלוסיות.
העובר דג הזברה הוא ב "המצע" vivo של בחירה כדי לנצל את הפוטנציאל הגדול המיוחס GEVIs. למעשה, הודות לבהירותה האופטית ולמערכת העצבים הפשוטה אך המשופעת שלה, מודל דג הזברה מאפשר זיהוי ומניפולציה פשוטים של כל רכיב סלולרי ברשת. ואכן, התעסוקה של FRET מבוססי בתולת הים GEVI 3 הובילה לזיהוי שינויים טרום סימפטומטיים בהתנהגות נוירון מוטורי עמוד השדרה במודל דג הזברה של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 4 .
להלן בפרוטוקול vivo מתאר כיצד לפקח על המאפיינים החשמליים של נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה של עוברי דג הזברה שלם להביע בתולת ים בצורה ספציפית נוירונים. יתר על כן, הוא מדגים כיצד chan המושרה pharmacologicallyגזים אלה תכונות חשמליות יכול להיות קשור שינויים בתדר של עובריים ספונטנית עובריים, פעילות מוטורית סטריאוטיפית המאפיינת את התנהגות התנועה של דג הזברה בשלבים מוקדמים מאוד של פיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן אפשר לנו לחקור את הקשר בין התכונות החשמליות של עוברי דג הזברה נוירונים מוטוריים עמוד השדרה ואת ההתנהגות סלילה ספונטנית, הפעילות הסטריאוטיפית המוקדם המוקדם ביותר, אשר מופיע סביב 17 hpf של התפתחות עובריים ונמשך עד 24 hpf 10 .
<p class="jove_content" st…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
