Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
El análisis in vivo del componente sistémico permite a los científicos investigar el comportamiento celular de la manera más confiable. Esto es particularmente cierto cuando la actividad bajo escrutinio está fuertemente influenciada por las interacciones célula-célula (tanto contacto como no contacto), como en el sistema nervioso, donde los cambios de voltaje de la membrana impulsan la comunicación entre las células excitables. La comprensión de la información codificada por estas señales eléctricas es la clave para entender la forma en que el sistema nervioso funciona tanto en estados fisiológicos como en estados de enfermedad.
Con el fin de estudiar las propiedades eléctricas de las células en las condiciones fisiológicas más no invasivas, varios indicadores de voltaje genéticamente codificados se han desarrollado recientemente 1 . A diferencia de las generaciones anteriores de sensores de voltaje óptico (principalmente sensibles a la tensión) 2 , las GEVI permiten análisis in vivo del sistema neural intacto, ySu expresión puede limitarse a tipos o poblaciones de células específicas.
El embrión de pez cebra es el "sustrato" in vivo de elección para aprovechar el gran potencial atribuido a los GEVI. De hecho, gracias a su claridad óptica y su sistema nervioso simplificado pero evolutivamente conservado, el modelo de pez cebra permite la identificación y manipulación directa de cada componente celular en una red. De hecho, el empleo de la GEVI basada en FRET Mermaid 3 condujo a la identificación de las alteraciones pre-sintomáticas en el comportamiento de la neurona motora espinal en un modelo de pez cebra de esclerosis lateral amiotrófica (ALS) [ 4] .
El siguiente protocolo in vivo describe cómo monitorear las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales en embriones intactos de pez cebra que expresan Mermaid de una manera neuronal específica. Por otra parte, se demuestra cómo farmacológicamente inducida chanEstas propiedades eléctricas pueden asociarse con alteraciones en la frecuencia de las bobinas espontáneas embrionarias, la actividad motora estereotípica que caracteriza el comportamiento del movimiento del pez cebra en etapas muy tempranas de desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí nos permitió explorar la asociación entre las propiedades eléctricas de las neuronas motoras espinales embrionarias del pez cebra y el comportamiento de bobinado espontáneo, la primera actividad motora estereotípica, que aparece alrededor de 17 hpf de desarrollo embrionario y dura hasta 24 hpf 10 .
Nuestro enfoque proporciona a los investigadores una herramienta para estudiar el sistema neural de embriones intactos, preservando compl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
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