Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
A análise de componentes sistêmicos in vivo permite que os cientistas investigem o comportamento celular da maneira mais confiável. Isto é particularmente verdadeiro quando a atividade sob escrutínio é fortemente influenciada pelas interações célula-célula (dependentes de contato e não contato), como no sistema nervoso, onde as mudanças de tensão da membrana conduzem a comunicação entre células excitáveis. A compreensão das informações codificadas por esses sinais elétricos é a chave para entender o funcionamento do sistema nervoso em estados fisiológicos e de doenças.
Para estudar as propriedades elétricas das células nas condições fisiológicas mais não-invasivas, vários indicadores de voltagem codificados geneticamente foram desenvolvidos recentemente 1 . Ao contrário das gerações anteriores de sensores de tensão óptica (principalmente corantes sensíveis à voltagem) 2 , os GEVIs permitem análises in vivo do sistema neural intacto eSua expressão pode ser limitada a tipos ou populações específicas de células.
O embrião de peixe-zebra é o "substrato" in vivo de escolha para aproveitar o grande potencial atribuído aos GEVIs. De fato, graças à sua clareza óptica e seu sistema nervoso simplificado mas evolutivamente conservado, o modelo zebrafish permite a identificação e manipulação direta de cada componente celular em uma rede. De fato, o emprego da GEVI Mermaid 3 baseada em FRET levou à identificação de alterações pré-sintomáticas no comportamento do neurônio motor espinhal em um modelo de esclerose lateral amiotrófica (ALS) 4 .
O seguinte protocolo in vivo descreve como monitorar as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral em embriões de peixe-zebra intactos que expressam a Sereia de maneira específica neuronal. Além disso, demonstra como chan induzido farmacologicamenteEssas propriedades elétricas podem ser associadas a alterações na freqüência de bobinas espontâneas embrionárias, a atividade motriz estereotípica que caracteriza o comportamento do movimento do peixe zebra em estágios de desenvolvimento muito iniciais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado permitiu explorar a associação entre as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral do embrião zebra eo comportamento espiral espiral, a atividade motriz estereotípica mais antiga, que aparece em torno de 17 hpf de desenvolvimento embrionário e dura até 24 hpf 10 .
Nossa abordagem fornece aos pesquisadores uma ferramenta para estudar o sistema neural de embriões intactos, preservando plenamente a complexidade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
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