Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
L' analisi di componenti sistemica in vivo consente agli scienziati di indagare sul comportamento cellulare in modo più affidabile. Ciò è particolarmente vero quando l'attività sotto controllo è fortemente influenzata dalle interazioni delle cellule cellulari (sia a contatto che a contatto non dipendente), come nel sistema nervoso, dove la tensione della membrana cambia la comunicazione tra le cellule eccitabili. La comprensione delle informazioni codificate da questi segnali elettrici è la chiave per comprendere il modo in cui il sistema nervoso funziona sia negli stati fisiologici che nelle malattie.
Per studiare le proprietà elettriche delle cellule nelle condizioni fisiologiche non invasive, sono stati recentemente sviluppati diversi indicatori di tensione geneticamente codificati 1 . Contrariamente alle precedenti generazioni di sensori di tensione ottica (principalmente coloranti sensibili alla tensione) 2 , GEVI consentono analisi in vivo del sistema neurale intatto eLa loro espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule o popolazioni.
L'embrione zebrafish è il "substrato" in vivo della scelta che sfrutta il grande potenziale attribuito ai GEVI. Infatti, grazie alla sua chiarezza ottica e al suo sistema nervoso semplificato ma evoluzionatamente conservato, il modello zebrafish consente la semplice identificazione e manipolazione di ogni componente cellulare in una rete. Infatti, l'impiego della GEET Mermaid 3 a base FRET ha portato all'identificazione di alterazioni pre-sintomatiche nel comportamento dei neuroni dei moti spinali in un modello zebrafish della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 4 .
Il seguente protocollo in vivo descrive come monitorare le proprietà elettriche dei neuroni del motore spinale in embrioni di zebrafish intatti che esprimono la Sirena in maniera specifica al neurone. Inoltre, dimostra come il farmaco farmacologicamente indottoIn tali proprietà elettriche può essere associato con alterazioni della frequenza delle bobine spontanee embrionali, l'attività stereotipica del motore che caratterizza il comportamento di movimento dei zebrafish in fasi molto avanzate di sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato ci ha consentito di esplorare l'associazione tra le proprietà elettriche dei neuroni dei motori spinali embrionali zebrafish e il comportamento spintaneo di avvolgimento, la prima attività motoria stereotipica, che si presenta intorno a 17 hpf di sviluppo embrionale e dura fino a 24 hpf 10 .
Il nostro approccio offre ai ricercatori uno strumento per studiare il sistema neurale di embrioni intatti, mantenendo pienamente la complessit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
References
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
