الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل
Summary
غالبا ما تحتوي على البروتينات المجالات المتعددة التي يمكن أن تمارس الوظائف الخلوية المختلفة. الجينات ضرب الرافضة (KO) لا يعتبرون هذا التنوع الوظيفي. هنا، نحن الإبلاغ عن النهج المستندة إلى هيكل الوظائف بوساطة إعادة التركيب الصرف كاسيت (RMCE) في KO الخلايا الجذعية الجنينية التي تسمح للتشريح الجزيئي للمجالات أو أنواع من البروتين وظيفية مختلفة.
Abstract
الهندسة الوراثية في الأجنة الماوس أو الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs) تسمح لدراسة وظيفة بروتين معين. البروتينات هي حقوله المنتجة من الخلية وتتكون غالبا من المجالات الوظيفية متعددة، والتي يمكن أن تتأثر التعديلات posttranslational. استنزاف البروتين بأكمله في مشروط أو التأسيسي الضربة القاضية من أصل (KO) الفئران لا يأخذ بعين الاعتبار هذا التنوع الوظيفي والتنظيم. وقد ذكرت سابقا خط مسك ونموذج الفأر المشتقة، التي تم إدراج موقع رسو السفن لFLPe الصرف كاسيت بوساطة إعادة التركيب (RMCE) في موضع ROSA26 (R26). هنا، ونحن التقرير على نهج هيكل الوظائف التي تسمح للتشريح الجزيئي للوظائف مختلفة من البروتين متعددة المجالات. وتحقيقا لهذه الغاية، يجب أن عبرت الفئران RMCE متوافق مع الفئران KO، ويجب أن تكون معزولة mESCs KO ثم RMCE متوافق. بعد ذلك، يمكن إدخال لجنة من ثوابت الإنقاذ المفترضة في موضع R26 عبر RMCE targetiنانوغرام. وcDNAs الإنقاذ مرشح يمكن إدراجها بسهولة بين المواقع RMCE للناقلات التي تستهدف باستخدام إعادة التركيب الاستنساخ. بعد ذلك، و transfected mESCs KO مع ناقلات تستهدف في تركيبة مع FLPe التعبير recombinase البلازميد. RMCE إعادة تنشيط الجين النيوميسين-مقاومة المروج أقل في مواقع رسو السفن ROSA26 ويسمح لاختيار الحدث الاستهداف الصحيح. وبهذه الطريقة، يتم الحصول على الكفاءات استهداف عالية قريبة من 100٪، والسماح لإدخال عدة ثوابت الإنقاذ المفترضة بطريقة الإنتاجية شبه عالية. وأخيرا، العديد من بنيات الإنقاذ مدفوعة R26-يمكن اختبار لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الذي لوحظ في mESCs KO الوالدين. نقدم دراسة بنية وظيفة إثبات صحة المبدأ في كاتينين P120 (p120ctn) mESCs KO باستخدام الأديم الباطن التمايز في الهيئات مضغي (EBS)، وقراءات المظهرية. هذا النهج يمكن تحديد المجالات الهامة، مسارات المصب المفترضة، ونقطة من الأمراض ذات الصلةالطفرات التي تكمن وراء الظواهر KO لبروتين معين.
Introduction
ويقدر أن جينومات الثدييات تحتوي على حوالي 20000 جينات تشفير البروتين. الربط البديل والتعديلات posttranslational يزيد من ذخيرة البروتين. البروتينات لديها بنية وحدات (1) وغالبا ما تحتوي على مجالات التفاعل متعددة، والتي تسمح تجنيدهم في المجمعات بروتين مختلفة، ومشاركتهم في العمليات الخلوية متعددة 2. ومن الأمثلة على ذلك البروتين متعدد الوظائف وتسمى p120ctn. يتم ترميز p120ctn بواسطة الجينات Ctnnd1 ويتكون من مجال أرماديلو تكرار مركزي كبير محاط من قبل N-المحطة ومنطقة C-المحطة. المجال أرماديلو من p120ctn بربط مجال juxtamembrane الحفظ جدا من cadherins الكلاسيكية، التي تشارك في التصاق خلية خلية، ولكنه يربط أيضا إلى قامع النسخي كايسو. المجال-N من محطة p120ctn يتفاعل مع تحركات مختلفة، فوسفاتاز، RhoGTPases صغيرة، والمرتبطة أنيبيب صroteins 3. ومن المثير للاهتمام، نتيجة الربط البديلة، الإسوية p120ctn يمكن أن تتولد من أربعة الكودونات بداية بديلة 4. p120ctn شكل الإسوي 1A هو أطول، كما ترجم من أكثر 5 "تبدأ كودون ويحتوي على شريحة-N محطة بالطول. في p120ctn الإسوية 3 و 4، يتم حذف هذه الشريحة N-المحطة جزئيا وكليا، على التوالي. فهم الدور الدقيق من البروتينات (أو الأشكال الإسوية البروتين)، والمجالات الخاصة بهم في الوظائف الخلوية المختلفة لا يزال يشكل تحديا.
الجينات التي تستهدف في mESCs يمكن دراسة وظيفة البروتين من خلال حذف الوراثي للجينات المقابلة وساهم على نطاق واسع لتحديد الجينات والممرات الهامة والأمراض ذات الصلة تنمويا. كان هذا الاختراق في علم الوراثة العكسية نتيجة التقدم في مجالات العزلة مسك والجينات التي تستهدف بسبب إعادة التركيب مثلي 5 </sتصل>. إعادة التركيب مثلي هو العملية التي يتم تبادلها شظايا الحمض النووي بين اثنين من الأنصاف النووية متشابهة أو متطابقة بعد المزدوج تقطعت بهم السبل (س) فواصل DNA. عادة، HR غير فعالة بسبب فواصل dsDNA نادرة. في الآونة الأخيرة، وكفاءة الجينات الموجهة تناظر تستهدف يمكن زيادة استخدام nucleases الخاصة بالموقع 6، 7، ولكن للأسف، هذه هي عرضة لتأثيرات بعيدا عن الهدف 8. وهناك تقنية أكثر موثوقية لتمكين الجينات الاستهداف RMCE، والتي تقوم على أنظمة إعادة التركيب في مواقع محددة مثل لجنة المساواة العرقية / loxP أو FLPe / FRT. تم العثور على LoxP وتسلسل FRT في P1 عاثية وخميرة الخباز، على التوالي، وتتكون من 34 شركة بريتيش بتروليوم، بما في ذلك شركة بريتيش بتروليوم تسلسل غير المتماثلة 8 التي تحدد التوجه للموقع. من ناحية أخرى، توجه، على سبيل المثال، موقعين loxP ضمن تمتد DNA ستحدد ما إذا كان DNA floxed يصبح رفعه أو طnversed على إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية-9. وعلاوة على ذلك، يمكن للجنة المساواة العرقية أيضا لحث على النبات إذا كانت موجودة موقعين على الكروموسومات المختلفة. RMCE يستفيد من مواقع إعادة التركيب مغاير نوعي التي لا عبر التفاعل والمضمنة في موضع الجيني. في ظل وجود البلازميد المانحة التي تحتوي على جزء DNA يحيط بها مواقع مغاير نوعي نفسها، فإن recombinase إدراج هذا جزء الحمض النووي في موضع-RMCE متوافق الجيني بسبب النبات المزدوج في وقت واحد (الشكل 1). هنا، يمكن استنساخ فقط بشكل صحيح RMCE المستهدفة تجعل بفضل المقاومة للأدوية إلى المروج على ناقلات الوارد أن يعيد "المحاصرين"، المروج أقل مقاومة نيومايسين الجين (النيو R) موجودة في الجينوم R26 من الخلايا لرسو السفن (الشكل 1) 10، 11. وهذا يؤدي إلى كفاءة استهداف عالية جدا، وغالبا ما يقرب من 100٪ 11 </ سوب> 12. وفي الختام، واستهداف القائم على RMCE ذو كفاءة عالية ويمكن استخدامها للدراسات وظائف الهيكل. ومع ذلك، فإنه يتطلب موضع الجيني سابقة الهندسة.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي لاستهداف بوساطة RMCE. RMCE يسمح لتبادل شرائح DNA من ناقلات تستهدف الواردة إلى مكان الجيني يعرف إذا كان كل من الميناء موقعين FRT مغاير نوعي (يصور مثلثات بيضاء وحمراء). وبالإضافة إلى ذلك، موضع الجيني المهندسة يحتوي على promoterless والجينات اقتطاع النيوميسين المقاومة (النيو R). من خلال توفير مروج والبدء في كودون في جزء DNA واردة، أحداث إعادة التركيب فقط الصحيحة استعادة المقاومة النيوميسين، مما أدى إلى الكفاءة استهداف عالية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من رشخصية له.
هندسة الجينوم في mESCs تسمح للجيل من الفئران RMCE متوافق. وفي عام 1981، نجحت مجموعتين في التقاط الخلايا المحفزة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) من الكيسات الأريمية والحفاظ عليها في الثقافة 13، 14. mESCs قادرة على تجديد الذات والتمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجنينية والكبار، بما في ذلك النسب الجرثومية الخلية. ولذلك، الجينات التي تستهدف في mESCs تمكن الدراسات عكس الوراثية من خلال تطوير الفئران KO التأسيسية أو المشروط (باستخدام نظام / LoxP لجنة المساواة العرقية). ومع ذلك، فإن الطريقة الكلاسيكية لعزل خلايا فأر ES غير فعالة للغاية. وزادت العديد من التحسينات الرئيسية إلى حد كبير نسبة النجاح لاشتقاق خطوط مسك، بما في ذلك استخدام تعريف مصل استبدال (SR) المتوسطة 15، بالتناوب بين مسك المتوسط تحتوي ريال والجنين مصل بقري (FBS) 16، واستخدام الصيدلانيةمركبات منطقية مثل pluripotin أو 2I 17. Pluripotin، وهو جزيء اصطناعي صغير، يسمح لنشر mESCs في حالة غير متمايزة في غياب عامل اللوكيميا المثبطة (LIF) والخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) 18. وأخيرا، فقد تبين أن mESCs يمكن عزل بكفاءة عالية جدا (قريبة من 100٪) عندما يتم الجمع بين و/ FBS بروتوكول التناوب المتوسط ريال مع LIF وpluripotin 19 و 20. وتمكن هذه البروتوكولات العزلة كفاءة mESCs KO-RMCE متوافق التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم للدراسات هيكل الوظائف.
توضح هذه الورقة الطريقة التي تمكن واحد لتحديد المجالات الرئيسية أو المخلفات داخل البروتين المسؤولة عن العمليات الخلوية محددة. تحقيقا لهذه الغاية، وكان خط أنابيب من التقنيات المتطورة التي تمكن كفاءة العزل مسك، وتستهدف الجمعية ناقلات، واستهداف مسك خلقد. على هذا النحو، لوحات كبيرة مع الإسوية البروتين، والمسوخ نطاق والمؤثرات المصب يمكن إدخالها في mESCs KO ويمكن تقييمها لقدرتها على إنقاذ في المختبر KO النمط الظاهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدينا طريقة مسك العزلة هو سهل الاستعمال ولا يتطلب مهارات متقدمة أو المعدات، مثل المجهرية من الكيسات الأريمية. وهكذا، وهذه التكنولوجيا يمكن الوصول إلى نسبة كبيرة من المجتمع العلمي. يمكن لأي شخص من ذوي الخبرة الأساسية ثقافة الخلية نشر الامتداد ICM وإنشاء خطوط mESCs. ومع ذ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Jinke وD'هونت، فريدريك فان Rockeghem، ناتالي Farla، كيلي ليمير، وRIET دي Rycke حصول على الدعم الفني الممتاز. كما نشكر EEF Parthoens، Evelien فان HAMME، وأماندا جونكالفيس من مرفق Bioimaging الأساسية لمركز أبحاث التهاب للحصول على مساعدة الخبراء التابعة لها. ونحن نعترف أعضاء مجموعتنا البحثية لإجراء مناقشات قيمة. وأيد هذا العمل من قبل سياسة البلجيكي العلوم (Belspo بين الجامعات الجذب البولنديين – جائزة IAP VII-07 DevRepair، https://devrepair.be)، من قبل مؤسسة الملكة إليزابيث الطبي، بلجيكا (GSKE 2008-2010، HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية .fmre-gske.be)، ومن قبل تطبيقات البحوث المنسقة (GOA 01G01908) من جامعة غنت، بلجيكا (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG هو زميل ما بعد الدكتوراه من صناديق البحوث فلاندرز (FWO-V).
Materials
| ROSALUC Mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| R26-iPSC mice | made in house | frozen sperm available upon request | |
| Vessel probe | Fine Science Tools | 10160-13 | to check for copulation plugs |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | make aliquots and store at -20°C |
| Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) | Fine Science Tools | 11251-10 | spray with 70% EtOH before use (do not autoclave) |
| 23G needles | Fine-ject | 8697 | |
| 1-ml syringes | Soft-ject | 6680 | |
| 60-mm bacterial grade plates (for flushing) | Gosselin | BB60-01 | |
| Mouth pipette | made in house | see discussion | |
| Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) | ATTC | SCRC-1045 | |
| TgN (DR4)1 Jae mice | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Mitomycin C | Sigma-Aldrich | M0503 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 14190-094 | |
| Tg(DR4)1Jae/J mice | JAX | 3208 | mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine |
| 0.1% Gelatin | Sigma-Aldrich | G1393 | Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C. |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200-056 | |
| 2 μM pluripotin | Cayman Chemical | 10009557 | |
| pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08870 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| cre-excised pRMCE-DV1 | BCCM/LMBP collection | LMBP 08195 | public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) |
| pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA | Addgene | 20733 | |
| heat-shock competent DH5α bacteria | made in house | ||
| Gateway pDONR221 vector | Thermo Fisher | 12536-017 | contains kanamycin-resistance gene |
| BP clonase II mix | Thermo Fisher | 11789-020 | |
| LR clonase II mix | Thermo Fisher | 11791-020 | |
| Luria Broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer | Thermo Fisher | 3730XL | |
| G418 | Thermo Fisher | 11811-023 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668027 | |
| Lipofectamine LTX transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GATEWAY pENTR 1A vector | Thermo Fisher | A10462 | recombination-compatible vector |
| mouse monoclonal anti-p120ctn antibody | BD Transduction Laboratories | 610134 | |
| mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody | BD Transduction Laboratories | 610181 | |
| General equipment: | |||
| Sterile dissection tools | fine scissors and forceps for dissecting the uterus | ||
| Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml | |||
| 15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes | |||
| 96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) | |||
| Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells | |||
| Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl) | |||
| Sterile multichannel reservoirs | |||
| Access to a laminar air flow | |||
| Access to an incubator at 37°C with 5% CO2 | |||
| Access to an inverted microscope | |||
| Access to a bench-top centrifuge | |||
| Access to a stereo microscope with transmitted-light | |||
| Culture media: | |||
| MEF Medium: | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 41965-062 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F-7524 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium pyruvate (0.4 mM) | Gibco | 11360-039 | |
| penicillin (100 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| SR-based mESC medium: | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 31330-038 | mixed in a 1:1 ratio |
| 15% knock-out serum replacement (SR ) | Gibco | 10828–028 | |
| L-glutamine (2 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| 0.1 mM non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin (100 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| β-mercaptoethanol (0.1 mM) | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| 2,000 U/ml recombinant mouse LIF | (IRC/VIB Protein Service facility) | ||
| FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium): | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| Differention Medium | stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use | ||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
| 15% FBS | Hyclone | SH30070.03E | |
| 5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid | Gibco | 11279-023 | |
| 2 mM L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| 0.4 mM 1-thioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
| 50 μg/ml ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A-4544 | |
| penicillin (100 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| streptomycin (100 µg/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| 2i | |||
| 1 μM Erk inhibitor PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | |
| 3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 |
References
- Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F. Functions of p120ctn in development and disease. Front Biosci. 17, 760-783 (2012).
- Keirsebilck, A., et al. Molecular cloning of the human p120ctn catenin gene (CTNND1): Expression of multiple alternatively spliced isoforms. Genomics. 50, 129-146 (1998).
- Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6, 507-512 (2005).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6, 7-28 (2004).
- Sandhu, U., et al. Strict control of transgene expression in a mouse model for sensitive biological applications based on RMCE compatible ES cells. Nucleic Acids Res. 39, 1 (2010).
- Haenebalcke, L., et al. Efficient ROSA26-based conditional and/or inducible transgenesis using RMCE-compatible F1 hybrid mouse embryonic stem cells. Stem Cell Rev. 9, 774-785 (2013).
- Pieters, T., et al. p120 Catenin-Mediated Stabilization of E-Cadherin Is Essential for Primitive Endoderm Specification. PLoS Genet. 12, e1006243 (2016).
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 7634-7638 (1981).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Bryja, V., et al. An efficient method for the derivation of mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 844-849 (2006).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., et al. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17266-17271 (2006).
- Pieters, T., et al. Efficient and User-Friendly Pluripotin-based Derivation of Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cell Rev. 8, (2012).
- Yang, W., et al. Pluripotin combined with leukemia inhibitory factor greatly promotes the derivation of embryonic stem cell lines from refractory strains. Stem Cells. 27, 383-389 (2009).
- Haenebalcke, L., et al. The ROSA26-iPSC Mouse: A Conditional, Inducible, and Exchangeable Resource for Studying Cellular (De)Differentiation. Cell Rep. 3, (2013).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Res. 25, 3745-3746 (1997).
- Nyabi, O., et al. Efficient mouse transgenesis using Gateway-compatible ROSA26 locus targeting vectors and F1 hybrid ES cells. Nucleic Acids Res. 37, 55 (2009).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
- Schaft, J., Ashery-Padan, R., vander Hoeven, F., Gruss, P., Stewart, A. F. Efficient FLP recombination in mouse ES cells and oocytes. Genesis. 31, 6-10 (2001).
- Spencer, H. L., et al. E-cadherin inhibits cell surface localization of the pro-migratory 5T4 oncofetal antigen in mouse embryonic stem cells. Mol Biol Cell. 18, 2838-2851 (2007).
- Stryjewska, A., et al. Zeb2 Regulates Cell Fate at the Exit from Epiblast State in Mouse Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2016).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77, 70-82 (2013).
- Li, J., et al. The EMT transcription factor Zeb2 controls adult murine hematopoietic differentiation by regulating cytokine signaling. Blood. , (2016).
