Structure-fonction des études chez la souris à l'aide de cellules souches embryonnaires recombinase médiation cassette d'échange

Summary

Les protéines contiennent souvent plusieurs domaines qui peuvent exercer différentes fonctions cellulaires. knock-out gène (KO) ne considèrent pas cette diversité fonctionnelle. Nous rapportons ici un échange de cassette à médiation recombinaison (CREM) approche structure-fonction dans les cellules à base de souches embryonnaires KO qui permet la dissection moléculaire de différents domaines fonctionnels ou variants d'une protéine.

Abstract

génie génétique dans des embryons de souris ou de cellules souches embryonnaires (mESCs) permet l'étude de la fonction d'une protéine donnée. Les protéines sont les chevaux de trait de la cellule et sont souvent constitués de multiples domaines fonctionnels, qui peuvent être influencés par des modifications post-traductionnelles. L'épuisement de la protéine entière chez les souris knock-out conditionnel ou constitutive (KO) ne prend pas en compte cette diversité fonctionnelle et de la réglementation. Une ligne MESC et un modèle de souris dérivé, dans lequel un site d'amarrage pour l'échange de cassette de recombinaison à médiation par FLPE (CREM) a été insérée dans le locus ROSA26 (R26), a été précédemment rapporté. Nous présentons ici une approche structure-fonction qui permet la dissection moléculaire des différentes fonctionnalités d'une protéine multidomaine. A cet effet, les souris compatibles CREM doivent être croisées avec des souris KO et KO mESCs compatibles CREM doivent être isolés. Ensuite, un panel de constructions de sauvetage putatifs peut être introduit dans le locus R26 via CREM targeting. Les cDNA de sauvetage candidats peuvent être facilement insérés entre les sites CREM du vecteur de ciblage en utilisant le clonage de recombinaison. Ensuite, KO mESCs sont transfectées avec le vecteur de ciblage en combinaison avec un plasmide d'expression de recombinase FLPE. CREM le gène réactive résistance à la néomycine promoteur moins dans les sites d'accueil Rosa26 et permet la sélection de l'événement correct de ciblage. De cette manière, l'efficacité élevée de ciblage proches de 100% sont obtenus, ce qui permet l'insertion de plusieurs constructions de sauvetage putatifs d'une manière semi-débit élevé. Enfin, peut être testé une multitude de constructions de secours entraînées R26 pour leur capacité à sauver le phénotype qui a été observé dans mESCs KO parental. Nous présentons une étude de validation de principe structure-fonction dans p120 caténine (p120ctn) KO mESCs en utilisant la différenciation endoderme dans les corps embryoïdes (EbS) comme lecture phénotypiques. Cette approche permet d'identifier des domaines importants, en aval des voies putatives, et point pertinent maladiemutations qui sous-tendent KO pour une phénotypes protéine donnée.

Introduction

On estime que les génomes de mammifères contiennent environ 20 000 gènes codant pour des protéines. L'épissage alternatif et modifications post-traductionnelles augmenter encore le répertoire de protéines. Les protéines ont une structure modulaire ¹ et contiennent souvent de multiples domaines d'interaction, qui permettent leur recrutement dans différents complexes de protéines et leur participation à de multiples processus cellulaires ^2. Un exemple est la protéine multifonctionnelle appelée p120ctn. p120ctn est codée par le gène Ctnnd1 et se compose d'un grand domaine de répétition de tatou centrale flanquée par une extrémité N-terminale et une région C-terminale. Le domaine de tatou p120ctn se lie à un domaine juxtamembranaire hautement conservée de cadhérines classiques, qui sont impliqués dans l'adhésion cellulaire des cellules, mais il se lie également au répresseur de la transcription Kaiso. Le domaine N-terminal de p120ctn interagit avec différentes kinases, les phosphatases, les petites GTPases Rho et associée aux microtubules proteins ^3. Il est intéressant, en raison de l' épissage alternatif, isoformes p120ctn peuvent être générés à partir de quatre codons de départ alternatifs ^4. p120ctn isoforme 1A est la plus longue, elle est traduite à partir de la plus 5' codon de départ et contient la longueur complète segment N-terminal. Dans p120ctn isoformes 3 et 4, ce segment N-terminal est supprimé partiellement et complètement, respectivement. Comprendre le rôle précis des protéines (ou isoformes de protéines) et leurs domaines dans différentes fonctions cellulaires reste un défi.

Le ciblage de gènes dans mESCs permet l'étude de la fonction d'une protéine à travers la deletion génétique du gène correspondant et a largement contribué à l'identification des gènes et les voies de développement importants et importantes maladies. Cette percée en génétique inverse a été le résultat des progrès dans les domaines de l' isolement MESC et ciblage de gène en raison de la recombinaison homologue ⁵ </sup>. La recombinaison homologue est un procédé dans lequel des fragments d'ADN sont échangés entre deux fragments nucléiques similaires ou identiques après cassures de l'ADN (DS) double brin. En règle générale, HR est inefficace parce que les pauses dsDNA sont rares. Récemment, l'efficacité de gène dirigé vers une homologie de ciblage pourrait être augmentée en utilisant des nucléases spécifiques à un site ^{6, 7,} mais , malheureusement, elles sont sujettes à des effets hors-cible ^8. Une technique plus fiable pour permettre le ciblage de gène est CREM, qui est basée sur des systèmes de recombinaison spécifiques au site tels que Cre / loxP ou FLPE / FRT. LoxP et la séquence Frt se trouvent dans le bactériophage P1 et Saccharomyces cerevisiae, respectivement, et se composent de 34 pb, comprenant une séquence de 8 pb asymétrique qui détermine l'orientation du site. D'autre part, l'orientation, par exemple, deux sites loxP dans un tronçon d'ADN déterminera si l'ADN floxés devient excisé ou inversed lors d'une recombinaison à médiation par Cre ^9. En outre, la Cre peut également induire une translocation si deux sites sont situés sur des chromosomes différents. CREM profite des sites de recombinaison hétérospécifiques qui ne sont pas provoquer une réaction croisée et qui sont incorporés dans un locus génomique. En présence d'un plasmide donneur qui contient un fragment d'ADN flanqué par les mêmes sites hétérospécifiques, la recombinase va insérer ce fragment d'ADN dans le locus génomique compatible CREM en raison de translocation à double simultanée (Figure 1). Ici, seuls correctement clones CREM ciblés peuvent rendre la résistance aux médicaments grâce à un promoteur sur le vecteur entrant qui restaure un « piégé », sans promoteur gène de résistance à la néomycine (Neo ^R) présente dans le génome R26 des cellules d'accueil (Figure 1) ^{10, 11.} Il en résulte une efficacité de ciblage très élevé, souvent près de 100% ^{11, <}/ sup> ^12. En conclusion, le ciblage par CREM-est très efficace et peut être utilisé pour les études de structure-fonctions; cependant, il a besoin d'un locus génomique précalculé.

Figure 1. Représentation schématique de ciblage à médiation par CREM. CREM permet l'échange de segments d'ADN à partir d'un vecteur de ciblage entrant à un locus génomique définie si les deux hébergent deux sites hétérospécifiques Frt (représentés par des triangles blancs et rouges). En outre, le locus génomique conçu contient un promoteur et un gène de résistance à la néomycine tronquée (Neo ^R). En fournissant un promoteur et codon de départ dans le fragment d'ADN entrant, seuls les événements de recombinaison restauration correcte résistance à la néomycine, entraînant des rendements élevés de ciblage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de tsa figure.

L'ingénierie des génomes en mESCs permet la génération de souris compatible CREM. En 1981, deux groupes ont réussi à capturer des cellules pluripotentes à partir de la masse cellulaire interne (ICM) de blastocystes et à les maintenir en culture ^{13, 14.} mESCs sont capables d'auto-renouvellement et de différenciation dans tous les types de cellules embryonnaires et adultes, y compris la lignée germinale. Par conséquent, le ciblage génique dans mESCs permet des études génétiques inverse par le développement de constitutifs ou conditionnels (en utilisant le système Cre / LoxP) souris KO. Cependant, la manière classique pour isoler des cellules ES de souris est très inefficace. Plusieurs améliorations importantes ont fortement augmenté le taux de succès pour dériver des lignes Mesc, y compris l'utilisation d'un sérum de remplacement défini (SR) moyen ^15, en alternant entre milieu MESC contenant du sérum bovin SR et fœtal (FBS) ^16, et l'utilisation de pharmacocomposés logiques tels que pluripotin ou ¹⁷ 2i. Pluripotin, une petite molécule synthétique, permet la propagation de mESCs dans un état indifférencié en l'absence de facteur inhibiteur de leucémie (LIF) et les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ^18. Enfin, il a été démontré que mESCs peuvent être isolés avec un rendement très élevé (proche de 100%) lorsqu'une SR / FBS protocole moyen d'alternance est combiné avec du LIF et pluripotin ^{19, 20.} Ces protocoles permettent l'isolement efficace de KO mESCs de CREM compatibles qui peuvent ensuite être utilisés pour des études structure-fonction.

Le présent document décrit une méthode que l'on permet d'identifier les domaines clés ou les résidus dans une protéine qui sont responsables des processus cellulaires spécifiques. À cette fin, un pipeline de technologies de pointe qui permettent l'isolement MESC efficace, le ciblage ensemble vecteur, et le ciblage MESC a été créeré. En tant que tel, de grands panneaux avec des isoformes de protéines, des mutants de domaine et effecteurs en aval peuvent être introduits dans KO mESCs et peuvent être évalués pour leur capacité à sauver le phénotype KO in vitro.

Protocol

Toutes les expériences sur des souris ont été menées conformément à la réglementation des animaux dans les institutions, nationales et européennes. 1. Isolement de mESCs KO CREM compatibles Breed souris hétérozygotes avec des souris KO compatible CREM, tels que des souris ROSALUC 10 ou souris ROSA26-COPSi 21. Les deux souris compatibles CREM ont été maintenues sur un mélange 129 / C57BL6 / fond suisse. NOTE: Le croisement avec des sou…

Representative Results

La procédure d'isoler les lignes compatibles CREM KO Mesc est représenté sur la figure 2. Deux consécutifs sont nécessaires Élevages pour obtenir des blastocystes KO compatible CREM. Tout d'abord, les souris KO hétérozygotes sont croisées avec des souris compatible CREM pour obtenir, souris hétérozygotes KO compatible CREM. Ces souris sont ensuite utilisées pour chronométrés avec d'autres conjugaisons souris KO hétérozygotes pour obtenir 3,5 d…

Discussion

Notre méthode d'isolement MESC est convivial et ne nécessite pas de compétences avancées ou de l'équipement, comme la microchirurgie de blastocystes. Ainsi, cette technologie est accessible à une grande partie de la communauté scientifique. Toute personne ayant une expérience de culture cellulaire de base peut se propager ICM excroissances et établir des lignes de mESCs. Cependant, le rinçage et la manipulation des blastocystes nécessite une certaine pratique. Une pipette de bouche est utilisé pour t…

Materials

ROSALUC Mice	made in house		frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice	made in house		frozen sperm available upon request
Vessel probe	Fine Science Tools	10160-13	to check for copulation plugs
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)	Fine Science Tools	11251-10	spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles	Fine-ject	8697
1-ml syringes	Soft-ject	6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)	Gosselin	BB60-01
Mouth pipette	made in house		see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice	JAX	3208	mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
heat-shock competent DH5α bacteria	made in house
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Luria Broth (LB)
Ampicillin
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody	BD Transduction Laboratories	610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment:
Sterile dissection tools			fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl)
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light
Culture media:
MEF Medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
Sodium pyruvate  (0.4 mM)	Gibco	11360-039
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
SR-based mESC medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR )	Gibco	10828–028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM non-essential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
β-mercaptoethanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/ml recombinant mouse LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamine	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-thioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386