Summary

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Published: April 27, 2017
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Summary

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Abstract

Gentechnik in Maus-Embryonen oder embryonale Stammzellen (mESCs) ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines bestimmten Proteins. Proteine ​​sind die Arbeitspferde der Zelle und bestehen oft aus mehreren funktionellen Domänen, die durch posttranslationale Modifikationen beeinflusst werden kann. Die Verarmung des gesamten Proteins in bedingten oder konstitutiv Knock-out (KO) Mäusen nimmt nicht berücksichtigt diese funktionale Vielfalt und Regulierung. Eine MESC Linie und ein abgeleitetes Mausmodell, in dem eine Andockstelle für FLPe Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) innerhalb des ROSA26 (R26) Locus eingefügt wurde, wurde bereits berichtet. Hier berichten wir über eine Struktur-Funktions-Ansatz, der für die molekulare Zerlegung der verschiedenen Funktionalitäten eines Multi-Domain Protein ermöglicht. Zu diesem Zweck RMCE-kompatible Mäuse müssen mit KO-Mäusen gekreuzt werden und dann RMCE-kompatibel KO mESCs isoliert werden müssen. Als nächstes kann ein Panel von putativen rescue-Konstrukten in die R26-Locus über RMCE targeti eingeführt werdenng. Die Kandidaten rescue cDNAs kann leicht zwischen RMCE Seiten des Targeting-Vektors unter Verwendung von Rekombinations-Klonierung eingefügt werden. Als nächstes wird KO mESCs mit dem Targeting-Vektor in Kombination transfiziert mit einer FLPe Rekombinase Expressionsplasmid. RMCE reaktiviert die promotorlose Neomycin-Resistenz-Gene in den ROSA26 Andockstellen und ermöglicht die Auswahl des korrekten Targeting-Ereignisses. Auf diese Weise werden hohe Wirkungsgrad Targeting von nahezu 100% erzielt, so dass zum Einsetzen mehrerer putativen rescue Konstrukte in eine halb-hohen Durchsatz Weise. Schließlich kann eine Vielzahl von R26 getriebenen Rettungs Konstrukte auf ihre Fähigkeit getestet werden, um den Phänotyp zu retten, die in Eltern KO mESCs beobachtet wurde. Wir präsentieren eine Proof-of-Principle-Struktur-Wirkungs-Studie in p120 Catenin (p120ctn) KO mESCs mit endoderm Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG) als phänotypische Anzeige. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von wichtigen Domänen, putative nachgeschaltete Wege und krankheitsrelevanten PunktMutationen, die KO-Phänotypen für ein bestimmtes Protein zu Grunde liegt.

Introduction

Es wird geschätzt, dass etwa 20.000 Säugergenomen Protein-kodierenden Gene enthalten. Alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen erhöhen die Proteinrepertoires. Proteine haben einen modularen Aufbau 1 und häufig mehrere Wechselwirkungsdomänen enthalten, die ihre Einstellung 2 in verschiedene Proteinkomplexe und ihre Beteiligung an mehreren zellulären Prozesse ermöglichen. Ein Beispiel dafür ist das multifunktionale Protein namens p120ctn. p120ctn wird durch das CTNND1 Gen codiert und besteht aus einer großen zentralen Domäne Armadillo – Repeat flankiert von einem N-terminalen und C-terminalen Region. Die Armadillo-Domäne von p120ctn bindet an eine hoch konservierten Juxtamembrandomäne der klassischen Cadherine, die in Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sind, aber es bindet auch an den Repressor Kaiso. Die N-terminale Domäne von p120ctn interagiert mit verschiedenen Kinasen, Phosphatasen, kleinen RhoGTPasen und Mikrotubuli-assoziierte proteins 3. Interessanterweise als Ergebnis des alternativen Spleißens, p120ctn Isoformen können 4 aus vier alternativen Startcodons erzeugt werden. p120ctn Isoform 1A ist die längste, wie es aus dem am meisten 5' translatiert wird Startcodon und enthält die Volllängen-N-terminales Segment. In p120ctn Isoformen 3 und 4 ist dieses N-terminale Segment teilweise gelöscht und vollständig sind. die genaue Rolle von Proteinen (oder Protein-Isoformen) und die Domänen in verschiedenen zellulären Funktionen zu verstehen, bleibt eine Herausforderung.

Gen-Targeting in mESCs ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines Proteins durch die genetische Deletion des entsprechenden Gens und hat weitgehend dazu beigetragen, die Identifizierung von entwicklungs wichtig und krankheitsrelevanten Genen und Wegen. Dieser Durchbruch in der reversen Genetik war das Ergebnis der Fortschritte in den Bereichen der MESC Isolierung und Gene aufgrund homologer Rekombination Targeting 5 </sup>. Homologe Rekombination ist ein Verfahren, bei der DNA-Fragmenten zwischen zwei ähnlichen oder identischen Nukleins Einheiten nach doppelsträngige (ds) DNA-Brüchen ausgetauscht werden. Normalerweise ist HR ineffizient, weil dsDNA Pausen selten sind. Seit kurzem wird die Effizienz der Homologie-directed gene targeting könnte unter Verwendung von ortsspezifischen Nucleasen erhöht 6, 7, aber unglücklicherweise sind diese anfällig für Nebeneffekte 8. Eine zuverlässigere Technik zu ermöglichen, Gen-Targeting ist RMCE, die auf ortsspezifische Rekombinationssysteme, wie Cre / loxP oder FLPe / FRT-basiert. LoxP und Frt – Sequenz werden in Bakteriophage P1 und Saccharomyces cerevisiae, bzw., und aus 34 bp, einschließlich einer asymmetrischen 8 – bp – Sequenz gefunden, die die Orientierung der Website festlegt. Auf der anderen Seite ist die Orientierung von, zum Beispiel, zwei loxP-Stellen innerhalb einer DNA-Strecke werden bestimmen, ob die floxed DNA exzidiert wird oder i9 nversed nach Cre-vermittelter Rekombination. Darüber hinaus kann Cre induziert auch eine Translokation, wenn zwei Standorte auf verschiedene Chromosomen befinden. RMCE nutzt artfremden Rekombinationsstellen, die nicht kreuzreagieren und das in einer genomischen Locus eingebettet sind. In Anwesenheit eines Donator – Plasmid , das ein DNA – Fragment mit den gleichen hetero Stellen flankierte enthält, fügt die Rekombinase dieses DNA – Fragment in den kompatibelen RMCE genomischen Locus durch doppelte versetzte Translokation (Abbildung 1). Hier wird nur richtig RMCE gezielte Klone können drug resistance dank eines Promotors auf dem ankommenden Vektor rendern , die ein „gefangen“ , stellt promotorlose Neomycinresistenzgen (Neo R) in der R26 Genom der Docking – Zellen (Abbildung 1) 10, 11. Daraus ergibt sich eine sehr hohe Targeting Effizienz, oft nahe 100% 11 </ sup> 12. Abschließend ist RMCE basierte Targeting sehr effizient und kann für Struktur-Funktionen Studien verwendet werden; Jedoch erfordert es eine vorgefertigte genomischen Locus.

Abbildung 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der RMCE Vermittelte Targeting. RMCE ermöglicht den Austausch von DNA-Segmenten aus einem ankommenden Targeting-Vektor zu einem definierten genomischen Locus, wenn sowohl zwei hetero FRT-Stellen Harbor (dargestellt durch weiße und rote Dreiecke). Darüber hinaus enthält das manipulierte genomischen Locus und ein promotorloses Neomycin-Resistenz verkürztes (Neo R) -Gen. Durch die Bereitstellung von Wiederherstellung einen Promotor und Startcodon in dem ankommenden DNA-Fragmente, nur korrekte Rekombinationsereignisse Neomycin-Resistenz, was zu hohen Effizienzen Targeting. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version t anzuzeigenseine Figur.

Genomtechnik in mESCs ermöglicht die Erzeugung von RMCE-kompatible Mäuse. Im Jahr 1981 gelang es zwei Gruppen von pluripotenten Zellen der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten in Erfassung und in Kultur 13, 14 aufrechtzuerhalten. mESCs der Lage ist, die Selbsterneuerung und Differenzierung in alle Arten von embryonalen und adulten Zellen, einschließlich der Keimzelllinie. Daher Gene in mESCs Targeting ermöglichen Reverse genetische Studien über die Entwicklung von konstitutiven oder bedingten KO-Mäusen (die Cre / loxP-System verwendet wird). Allerdings ist die klassische Art und Weise Maus-ES-Zellen zu isolieren, ist sehr ineffizient. Verschiedene Verbesserungen haben große stark erhöht die Erfolgsrate für die Ableitung MESC Linien, einschließlich der Verwendung eines definierten serum-Ersatz (SR) Medium 15, im Wechsel zwischen MESC Medium SR und fötales Rinderserum (FBS) , 16, und die Verwendung von pharmakodynamischen enthaltendlogische Verbindungen wie pluripotin oder 2i 17. Pluripotin, ein kleines synthetisches Molekül, ermöglicht die Ausbreitung von mESCs in einem undifferenzierten Zustand in Abwesenheit von Leukämie – Hemmfaktor (LIF) und embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) 18. Schließlich hat es sich gezeigt , dass mESCs kann mit einem sehr hohen Wirkungsgrad ( in der Nähe von 100%) isoliert werden , wenn ein SR / FBS – Medium Wechsel – Protokoll mit LIF kombiniert und pluripotin 19, 20. Diese Protokolle ermöglichen die effiziente Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs, die anschließend für Struktur-Funktions-Studien verwendet werden können.

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren, das man die Schlüssel-Domänen oder Reste innerhalb eines Proteins zu identifizieren, ermöglicht es, die für spezifische zelluläre Prozesse verantwortlich sind. Zu diesem Zweck wird eine Pipeline von fortschrittlichen Technologien, die eine effiziente MESC Isolierung ermöglichen, Targeting-Vektor Montage und MESC Targeting war erstellend. Als solche großen Platten mit Proteinisoformen, Domain – Mutanten und Effektoren können in KO mESCs eingeführt werden können und für ihre Fähigkeit , die invitro – KO – Phänotyp zu retten ausgewertet werden.

Protocol

Alle Versuche an Mäusen wurden nach institutionellen, nationalen und europäischen Tiere Vorschriften durchgeführt. 1. Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs Breed heterozygot KO – Mäuse mit RMCE-kompatible Mäuse, wie ROSALUC Mäuse 10 oder ROSA26-iPS – Mäuse 21. Beide RMCE-kompatible Mäuse wurden auf einem Misch 129 / C57BL6 / Swiss Hintergrund gehalten. HINWEIS: Kreuzung mit heterozygot KO-Mäusen wird empfohlen, embryonale Letalität in …

Representative Results

Das Verfahren RMCE-kompatiblen KO MESC Linien zu isolieren , ist in Abbildung 2 dargestellt. Zwei aufeinanderfolgende Züchtungen sind erforderlich RMCE-kompatibel KO Blastozysten zu erhalten. Zunächst werden heterozygot KO-Mäuse mit RMCE-kompatibelen Mäusen gekreuzt RMCE-kompatibel, heterozygot KO-Mäuse zu erhalten. Diese Mäuse werden dann für zeitlich Paarungen mit anderen heterozygot KO-Mäusen verwendet, zu erhalten, 3,5-dpc, RMCE-kompatibel, homozygot KO Blast…

Discussion

Unsere MESC Isolationsmethode ist benutzerfreundlich und erfordert keine fortgeschrittenen Fähigkeiten oder Ausrüstung, wie Mikrochirurgie von Blastozysten. Somit ist diese Technologie zu einem großen Teil der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich. Jeder, der Grundzellkultur Erfahrung kann ICM Auswüchse propagieren und mESCs Linien etablieren. Allerdings erfordert die Spülung und die Handhabung von Blastozysten etwas Übung. Ein Mundpipette wird verwendet Blastozysten zu übertragen und besteht aus einer Mikr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Jinke D'Hont, Frederique Van Rockeghem, Natalie Farla, Kelly Lemeire und Riet De Rycke für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken auch Eef Parthoens, Evelien Van Hamme und Amanda Goncalves vom Bioimaging Core Facility des Inflammation Research Center für ihre Unterstützung von Experten. Wir erkennen an Mitglieder unserer Forschungsgruppe für wertvolle Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der belgischen Wissenschaftspolitik unterstützt (BELSPO Interuniversitäre Anziehungsschwerpunkte – Preis IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), von der Königin Elisabeth-Stiftung für Medizin, Belgien (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be) und der konzertierten Forschungsaktionen (GOA 01G01908) der Universität Gent, Belgien (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG ist ein Postdoctoral Fellow der Flandern Forschungsfonds (FWO-V).

Materials

ROSALUC Mice made in house frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice made in house frozen sperm available upon request
Vessel probe Fine Science Tools 10160-13 to check for copulation plugs
M2 medium Sigma-Aldrich M7167 make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps) Fine Science Tools 11251-10 spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles Fine-ject 8697
1-ml syringes Soft-ject 6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)  Gosselin BB60-01
Mouth pipette made in house see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain) ATTC SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice The Jackson Laboratory 3208
Mitomycin C  Sigma-Aldrich M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice JAX 3208 mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin Sigma-Aldrich G1393 Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)  Gibco 25200-056
2 μM pluripotin Cayman Chemical 10009557
pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08870 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
cre-excised pRMCE-DV1 BCCM/LMBP collection  LMBP 08195 public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA  Addgene 20733
heat-shock competent DH5α bacteria  made in house
Gateway pDONR221 vector Thermo Fisher 12536-017 contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix Thermo Fisher 11789-020
LR clonase II mix Thermo Fisher 11791-020 
Luria Broth (LB) 
Ampicillin 
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer Thermo Fisher 3730XL
G418 Thermo Fisher 11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher 11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent Thermo Fisher 15338100
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
GATEWAY pENTR 1A vector Thermo Fisher A10462 recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody BD Transduction Laboratories 610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody BD Transduction Laboratories 610181
General equipment:
Sterile dissection tools fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom) 
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl) 
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light 
Culture media:
MEF Medium: stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 41965-062
10% fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F-7524
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
Sodium pyruvate  (0.4 mM) Gibco 11360-039 
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
SR-based mESC medium: stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12 Gibco 31330-038 mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR ) Gibco 10828–028
L-glutamine (2 mM) Gibco 25030-024 
0.1 mM non-essential amino acids  Gibco 11140-050
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
β-mercaptoethanol (0.1 mM)  Sigma-Aldrich M 3148 
2,000 U/ml recombinant mouse LIF  (IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium): stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM Gibco 10829-018 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
Differention Medium stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Gibco 21980-032 
15% FBS Hyclone SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid   Gibco 11279-023 
 2 mM L-glutamine Gibco 25030-024 
0.4 mM 1-thioglycerol Sigma-Aldrich M-6145
50 μg/ml ascorbic acid Sigma-Aldrich A-4544 
penicillin (100 U/ml) Gibco 15140-122 
streptomycin (100 µg/ml) Gibco 15140-122 
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901  Axon Medchem Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386

References

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Pieters, T., Haenebalcke, L., Bruneel, K., Vandamme, N., Hochepied, T., van Hengel, J., Wirth, D., Berx, G., Haigh, J. J., van Roy, F., Goossens, S. Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange. J. Vis. Exp. (122), e55575, doi:10.3791/55575 (2017).

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