Struktur og funktion Studier i embryonale stamceller fra mus Brug rekombinase-medieret Cassette Exchange

Summary

Proteiner indeholder ofte flere domæner, som kan øve forskellige cellulære funktioner. Gene knock-outs (KO) anser ikke denne funktionel diversitet. Her rapporterer vi en rekombinationsmedieret kassette udveksling (RMCE) -baseret struktur-funktion tilgang i KO embryonale stamceller, som giver mulighed for den molekylære dissektion af forskellige funktionelle domæner eller varianter af et protein.

Abstract

Genmanipulation i muse embryoer eller embryonale stamceller (mESCs) giver mulighed for undersøgelse af funktionen af ​​et givet protein. Proteiner er arbejdsheste cellen og ofte bestå af flere funktionelle domæner, som kan påvirkes af posttranslationelle modifikationer. Udtømningen af ​​hele proteinet i betinget eller konstitutiv knock-out (KO) mus tager ikke højde for denne funktionel diversitet og regulering. En Mesc linje og en afledt musemodel, hvori en docking site for FLPe rekombinationsmedieret kassette udveksling (RMCE) blev indsat i ROSA26 (R26) locus, er tidligere blevet rapporteret. Her rapporterer vi på en struktur-funktion tilgang, der muliggør molekylær dissektion af de forskellige funktioner i en multidomæneproteinet protein. Med henblik herpå skal RMCE-kompatibel mus krydses med KO mus og derefter RMCE-kompatible KO mESCs skal isoleres. Dernæst kan et panel af formodede rednings konstrukter indføres i R26 locus via RMCE targeting. Kandidatforbindelserne rednings cDNA'er kan nemt indsættes mellem RMCE sites af målvektoren ved hjælp rekombination kloning. Dernæst KO mESCs transficeret med målvektoren i kombination med et FLPe rekombinase ekspressionsplasmid. RMCE reaktiverer promotorløse neomycinresistensgen i ROSA26 docking sites og tillader selektion af den korrekte targeting event. På denne måde opnås høj målretning effektivitet tæt på 100%, hvilket muliggør indsættelse af flere formodede rednings konstruktioner i en semi-high throughput måde. Endelig kan et væld af R26-drevne rednings-konstruktioner testes for deres evne til at redde fænotype, der blev observeret i forældrenes KO mESCs. Vi præsenterer en proof-of-principle struktur-funktion undersøgelse i p120 catenin (p120ctn) KO mESCs anvender endoderm differentiering i embryoide legemer (EBS) som den fænotypiske udlæsning. Derigennem kan identifikation af vigtige domæner, formodede nedstrømsstier, og sygdomsfri relevante punktmutationer, der ligger til grund for KO fænotyper for et givet protein.

Introduction

Det anslås, at pattedyrgenomer indeholder omkring 20.000 proteinkodende gener. Alternativ splejsning og posttranslationelle modifikationer yderligere øge protein repertoire. Proteiner har en modulær struktur ¹ og ofte indeholde multiple interaktionsdomæner, som tillader deres rekruttering til forskellige protein-komplekser og deres deltagelse i flere cellulære processer ^2. Et eksempel er det multifunktionelle protein kaldet p120ctn. p120ctn kodes af Ctnnd1 genet og består af et stort centralt bæltedyr gentagelsesdomæne flankeret af en N-terminal og en C-terminal region. Bæltedyret domæne p120ctn binder til en særdeles konserveret juxtamembrandomæne af klassiske cadheriner, som er involveret i celle-celle-adhæsion, men det binder også til den transskriptionsrepressor Kaiso. Det N-terminale domæne af p120ctn interagerer med forskellige kinaser, phosphataser, små RhoGTPases og mikrotubulus-associeret proteins ^3. Interessant, som et resultat af alternativ splejsning, p120ctn isoformer kan genereres fra fire alternative startkodoner ^4. p120ctn isoform 1A er den længste, da det er oversat fra den mest-5' startkodon og indeholder fuldlængde N-terminale segment. I p120ctn isoformerne 3 og 4 er dette N-terminale segment delvist og fuldstændigt henholdsvis slettet. Forstå den præcise rolle proteiner (eller protein-isoformer) og deres domæner i forskellige cellulære funktioner fortsat en udfordring.

Genmålretning i mESCs muliggør studiet af funktionen af ​​et protein gennem genetisk deletion af det tilsvarende gen og har bredt bidraget til identifikation af udviklingsmæssigt vigtige og sygdomsrelaterede relevante gener og veje. Dette gennembrud i revers genetik var resultatet af fremskridt inden for Mesc isolation og genmålretning grund homolog rekombination ⁵ </sop>. Homolog rekombination er en proces, hvor DNA-fragmenter udveksles mellem to lignende eller identiske nucleinsyre-dele efter dobbeltstrenget (ds) DNA-brud. Normalt HR er ineffektivt, fordi dsDNA pauser er sjældne. Nylig kunne effektiviteten af homologi-dirigeret genmålretning øges ved anvendelse af stedspecifikke nukleaser ^{6, 7,} men desværre disse er tilbøjelige til off-target effekter ^8. En mere pålidelig teknik til at muliggøre genmålretning er RMCE, som er baseret på stedspecifikke rekombinationssteder systemer såsom Cre / loxP eller FLPe / Frt. LoxP og Frt sekvens findes i bakteriofag P1 og Saccharomyces cerevisiae henholdsvis og består af 34 bp, herunder en asymmetrisk 8 bp sekvens, der bestemmer orienteringen af sitet. På den anden side, orienteringen af ​​for eksempel to loxP-sites inden for en DNA-strækning vil afgøre, om floxed DNA bliver udskåret eller inversed upon Cre-medieret rekombination ^9. Desuden kan Cre også inducere en translokation hvis to steder er placeret på forskellige kromosomer. RMCE drager fordel af Heterospecifikke rekombinationssteder, der ikke krydsreagerer, og som er indlejret i et genomisk locus. I nærvær af et donorplasmid, der indeholder et DNA-fragment flankeret af de samme Heterospecifikke sites, vil rekombinasen indsætte dette DNA-fragment i RMCE-kompatible genomiske locus på grund af dobbeltstrenget samtidig translokation (figur 1). Her, kan kun korrekt RMCE-målrettede kloner gøre lægemiddelresistens takket være en promotor på den indkommende vektor, som genskaber en "fanget," promotor-mindre neomycinresistensgen ^(NeoR) til stede i R26-genomet af docking-celler (figur 1) ^{10, 11.} Dette resulterer i en meget høj målretning effektivitet, ofte tæt på 100% ^{11, <}/ sup> ^12. Afslutningsvis RMCE målretning er yderst effektiv og kan anvendes til struktur-funktioner undersøgelser; men det kræver en præfabrikerede genomiske locus.

Figur 1. Skematisk repræsentation af RMCE-medieret Målretning. RMCE giver mulighed for udveksling af DNA-segmenter fra et indkommende vektor målretning til en defineret genomisk locus hvis begge harbor to Heterospecifikke FRT-steder (skildret af hvide og røde trekanter). Derudover den konstruerede genomiske locus indeholder et promotorløst og trunkeret neomycin-resistens ^(NeoR) gen. Ved at tilvejebringe en promotor og startkodon i den indkommende DNA-fragment, kun korrekte rekombinationsbegivenheder genoprette neomycinresistens, hvilket resulterer i effektiviteter høje målretning. Klik her for at se en større version af thans figur.

Genommanipulation i mESCs muliggør frembringelsen af ​​RMCE-kompatibel mus. I 1981, to grupper formået at tage pluripotente celler fra den indre cellemasse (ICM) af blastocyster og opretholdelse dem i kultur ^{13, 14.} mESCs er i stand til selvfornyelse og differentiering i alle typer af embryonale og voksne celler, herunder kim-celle afstamning. Derfor genmålretning i mESCs muliggør omvendt genetiske undersøgelser gennem udvikling af konstitutive eller betingede (ved hjælp af Cre / LoxP-system) KO-mus. Men den klassiske måde at isolere mus ES-celler er meget ineffektiv. Flere store forbedringer har stærkt forøget succesraten for afledt Mesc linjer, herunder anvendelse af et defineret serum-udskiftning (SR) medium ^15, vekslende mellem Mesc medium indeholdende SR og føtalt bovint serum (FBS) ^16, og anvendelsen af farmakologiske forbindelser, såsom pluripotin eller 2i ^17. Pluripotin, en lille syntetisk molekyle, giver mulighed for opformering af mESCs i en udifferentieret tilstand i fravær af leukæmiinhiberende faktor (LIF) og muse embryonale fibroblaster (MEF) ^18. Endelig er det blevet vist, at mESCs kan isoleres med en meget høj effektivitet (næsten 100%), når en SR / FBS medium alternerende protokol er kombineret med LIF og pluripotin ^{19, 20.} Disse protokoller muliggør effektiv isolering af RMCE-kompatibel KO mESCs, der efterfølgende kan anvendes til struktur-funktions-undersøgelser.

Dette papir beskriver en fremgangsmåde, der gør det muligt at identificere de vigtigste domæner eller rester i et protein, der er ansvarlige for specifikke cellulære processer. Til dette formål en pipeline af avancerede teknologier, der muliggør effektiv Mesc isolation, målrettede vektor samling, og Mesc målretning var skabed. Som sådan, store paneler med proteinisoformer, domæne mutanter og nedstrømseffektorer kan indføres i KO mESCs og kan evalueres for deres evne til at redde in vitro KO fænotype.

Protocol

Alle forsøg på mus blev udført i henhold til de institutionelle, nationale og europæiske dyr regler. 1. Isolering af RMCE-kompatible KO mESCs Avle heterozygote KO-mus med RMCE-kompatible mus, såsom ROSALUC mus 10 eller ROSA26-iPSC mus 21. Begge RMCE-kompatible mus blev holdt på en blandet 129 / C57BL6 / Swiss baggrund. BEMÆRK: Passage med heterozygote KO mus tilrådes at overvinde embryonal letalitet i homozygote KO mus. Anvende P…

Representative Results

Fremgangsmåden til isolering RMCE-kompatibel KO Mesc linjer er afbildet i figur 2. To på hinanden følgende parringer skal indhente RMCE-kompatibel KO blastocyster. For det første er heterozygote KO mus krydset med RMCE-kompatibel mus for at opnå RMCE-kompatibel, heterozygote KO mus. Disse mus anvendes derefter til timede parringer med andre heterozygote KO mus for at opnå 3,5-dpc, RMCE-kompatibel, homozygote KO blastocyster. Muligheden for at opnå en sådan embryo…

Discussion

Vores Mesc isolation metode er brugervenlig og kræver ikke avancerede færdigheder eller udstyr, såsom mikrokirurgi af blastocyster. Således er denne teknologi er tilgængelig for en stor del af det videnskabelige samfund. Enhver med grundlæggende cellekultur erfaring kan forplante ICM udvækster og etablere mESCs linjer. Men skylningen og håndtering af blastocyster kræver nogle praksis. En mundpipette bruges til at overføre blastocyster og består af en mikropipette, en mikropipette holder, slanger og en aspirat…

Materials

ROSALUC Mice	made in house		frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice	made in house		frozen sperm available upon request
Vessel probe	Fine Science Tools	10160-13	to check for copulation plugs
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)	Fine Science Tools	11251-10	spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles	Fine-ject	8697
1-ml syringes	Soft-ject	6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)	Gosselin	BB60-01
Mouth pipette	made in house		see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice	JAX	3208	mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
heat-shock competent DH5α bacteria	made in house
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Luria Broth (LB)
Ampicillin
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody	BD Transduction Laboratories	610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment:
Sterile dissection tools			fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl)
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light
Culture media:
MEF Medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
Sodium pyruvate  (0.4 mM)	Gibco	11360-039
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
SR-based mESC medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR )	Gibco	10828–028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM non-essential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
β-mercaptoethanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/ml recombinant mouse LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamine	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-thioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386