L'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em> Dans Utero</em> Electroporation
Summary
Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.
Abstract
L' électroporation in utero est une approche rapide et puissante pour étudier le processus de migration radiale dans le cortex cérébral du développement d'embryons de souris. Il a aidé à décrire les différentes étapes de la migration radiale et à caractériser les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce processus. Pour analyser directement et dynamiquement les neurones migrateurs, ils doivent être tracés dans le temps. Ce protocole décrit un flux de travail qui combine l' électroporation utérotique avec la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle, ce qui permet un examen direct et une analyse dynamique des neurones corticaux migrant radialement. En outre, une caractérisation détaillée des neurones migrateurs, tels que la vitesse de migration, les profils de vitesse, ainsi que les changements d'orientation radiale, est possible. La méthode peut facilement être adaptée pour effectuer des analyses fonctionnelles de gènes d'intérêt pour la migration radiale des neurones corticaux par perte et gain de fonction ainsi que des expériences de sauvetage. Laps de tempsL'imagerie des neurones migrateurs est une technique de pointe qui, une fois établie, est un outil puissant pour étudier le développement du cortex cérébral dans les modèles de souris des troubles de la migration neuronale.
Introduction
Le néocortex est le principal site de fonctions cognitives, émotionnelles et sensoriomotrices. Il est composé de six couches horizontales orientées parallèlement à la surface du cerveau. Au cours du développement, les cellules progénitrices dans la paroi latérale du télencephalon dorsal donnent lieu à des neurones de projection qui migrent radialement vers la surface du pial et qui acquièrent une identité neuronale spécifique au type de couche. Après avoir été généré dans les zones ventriculaires / subventriculaires (VZ / SVZ), ces neurones deviennent transitoirement multipolaires et ralentissent leur migration. Après un court séjour dans la zone intermédiaire (IZ), ils passent à une morphologie bipolaire, attachent à l'échafaudage radial et poursuivent une migration orientée radialement vers la plaque corticale (CP). Après avoir atteint leur cible finale, les neurones se détachent des processus de glande radiale et acquièrent une identité spécifique de la couche. Les mutations dans les gènes affectant différentes étapes de la migration neuronale peuvent causer de graves malformations corticales, telles que lissencL'hétérotopie de l'ephalie ou de la matière blanche 1 , 2 .
L' électroporation in utero est une technique rapide et puissante pour transfecter des cellules progénitrices neurales dans le cerveau en développement d'embryons de rongeurs 3 , 4 . Avec cette technique, il est possible de supprimer et / ou de surexprimer les gènes d'intérêt afin d'étudier leurs fonctions dans le développement des neurones. Cette méthode a spécifiquement aidé à décrire les détails morphologiques et à caractériser les mécanismes moléculaires du processus de migration radiale 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Les neurones qui migrent radialement subissent des changements dynamiques dans la forme de la cellule, la vitesse de migration, ainsi que la direction migratoire, qui nécessitent une observation directe et continue au fil du temps. Cultivé en tranches organotypiquesL'imagerie confocale à temps réel et temporelle des cerveaux électroporés permet d'observer directement les neurones migrateurs dans le temps. En utilisant cette approche combinée, il est possible d'analyser des caractéristiques distinctes des neurones migrateurs qui ne peuvent pas être étudiées dans des coupes fixes de tissus de cerveaux électroporés.
Nous avons récemment appliqué l'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans les cultures en tranche de cerveaux électroporés pour étudier le rôle du facteur de transcription CLL / lymphome 11a (Bcl11a) pendant le développement cortical 10 . Bcl11a s'exprime chez les jeunes neurones corticaux migrateurs et nous avons utilisé un allèle Bcl11a mutant conditionnel ( Bcl11a flox ) 11 pour étudier ses fonctions. L'électroporation de Cre recombinase avec la protéine fluorescente verte (GFP) dans les progéniteurs corticaux des cerveaux Bcl11a flox / flox nous a permis de créer une situation de mutant de mosaïque, dans laquelle seulement quelques cellules sont mutées dans unSinon un arrière-plan de type sauvage. De cette façon, il était possible d'étudier les fonctions autonomes de cellules de Bcl11a au niveau de cellule unique. Nous avons constaté que les neurones mutants Bcl11a affichent une vitesse réduite, des changements dans leurs profils de vitesse, ainsi que des changements d'orientation aléatoires pendant leur migration 10 . Dans le protocole décrit, nous décrivons un flux de travail pour l'élimination réussie de l'électroporation et la préparation des cultures en tranche 12 du cerveau de la souris, ainsi que l'imagerie confocale temporelle des cultures corticales en tranches.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migration radiale est un processus clé dans le développement de neocortex. Les mutations dans les gènes affectant différentes étapes de ce processus peuvent provoquer des malformations corticales sévères, y compris lissencéphalie et hétérotopie blanche 1 , 2 . Nous avons récemment montré que Bcl11a, qui s'exprime dans les jeunes neurones de projection corticale migratoire, joue un rôle dans la migration radiale. Nous avons utilisé une imager…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka et Matthias Toberer pour une excellente assistance technique, ainsi que Victor Tarabykin pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
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