Время-замедление конфокальной визуализации мигрирующих нейронов в органотипической культуре срезов мозга эмбриональной мыши с использованием<em> В Утеро</em> Электротовары
Summary
Этот протокол содержит инструкции по прямому наблюдению радиально мигрирующих кортикальных нейронов. При внутриутробной электропорации органотипическая культура срезов и временная конфокальная визуализация объединяются для непосредственного и динамического изучения эффектов избыточной экспрессии или снижения регуляции генов, представляющих интерес в мигрирующих нейронах, и анализа их дифференциации во время развития.
Abstract
В утробе электропорация представляет собой быстрый и мощный подход к изучению процесса радиальной миграции в коре головного мозга развивающихся эмбрионов мыши. Это помогло описать различные этапы радиальной миграции и характеризовать молекулярные механизмы, контролирующие этот процесс. Чтобы напрямую и динамически анализировать миграционные нейроны, их нужно отслеживать с течением времени. В этом протоколе описывается рабочий процесс, который сочетается в электропорации с маточно- органическим строением с органотипической культурой срезов и временным конфокальным отображением, что позволяет провести прямой анализ и динамический анализ радиально мигрирующих кортикальных нейронов. Кроме того, возможна подробная характеристика мигрирующих нейронов, таких как скорость миграции, профили скорости, а также изменения радиальной ориентации. Этот метод может быть легко адаптирован для проведения функционального анализа генов, представляющих интерес для радиально мигрирующих корковых нейронов, путем потери и усиления функции, а также спасательных экспериментов. Промежуток времениВизуализация мигрирующих нейронов – это современная техника, которая когда-то была создана, является мощным инструментом для изучения развития коры головного мозга в моделях нейронов миграции мышц.
Introduction
Неокортекс является основным сайтом когнитивных, эмоциональных и сенсомоторных функций. Он состоит из шести горизонтальных слоев, ориентированных параллельно поверхности мозга. Во время развития клетки-предшественники в боковой стенке дорсального telencephalon приводят к появлению проекционных нейронов, которые мигрируют радиально к поверхности пиала и приобретают характер нейронов типа типа. После генерации в желудочковых / субвентрикулярных зонах (VZ / SVZ) эти нейроны становятся кратковременно многополярными и замедляют их миграцию. После короткого пребывания в промежуточной зоне (IZ) они переключаются на биполярную морфологию, прикрепляются к радиальному глиальному каркасу и продолжают радиально ориентированную миграцию в кортикальную пластинку (СР). По достижении конечной целевой проекции нейроны отделяются от процессов радиального глиального процесса и приобретают специфическую для слоя идентичность. Мутации в генах, влияющих на различные стадии миграции нейронов, могут вызывать сильную кортикальную мальформацию, такую как lissencEphaly или гетеротопия белого вещества 1 , 2 .
В утробе электропорация является быстрой и мощной методикой для трансфекции нейронных клеток-предшественников в развивающемся мозге эмбрионов грызунов 3 , 4 . С помощью этой методики можно подвергать нокдаун и / или сверхэкспрессировать гены, чтобы изучить их функции в развитии нейронов. Этот метод специально помог описать морфологические детали и характеризовать молекулярные механизмы процесса радиальной миграции 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Радиально мигрирующие нейроны подвергаются динамическим изменениям в форме клеток, скорости миграции, а также миграционному направлению, которые требуют постоянного и непрерывного наблюдения с течением времени. Органотипический кусочекПовторное и временное конфокальное изображение электропористых головных мозгов позволяют непосредственно наблюдать миграционные нейроны с течением времени. Используя этот комбинированный подход, можно проанализировать отдельные особенности мигрирующих нейронов, которые невозможно исследовать в фиксированных участках ткани электропористых головных мозга.
Недавно мы применяли временную конфокальную визуализацию мигрирующих нейронов в срезах культур электропористых головных мозгов для изучения роли фактора ВЛ-лимфомы 11-й клетки (Bcl11a) транскрипции в процессе развития коры 10 . Bcl11a экспрессируется в молодых мигрирующих кортикальных нейронах, и мы использовали условный мутант Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 для изучения его функций. Электропорация рекомбиназы Cre вместе с зеленым флуоресцентным белком (GFP) в корковые предшественники мозга Bcl11a flox / flox позволила нам создать мозаичную мутантную ситуацию, в которой только несколько клеток мутировали вВ противном случае фон дикого типа. Таким образом, можно было изучить автономные функции клеток Bcl11a на уровне отдельных ячеек. Мы обнаружили, что мутантные нейроны Bcl11a демонстрируют пониженную скорость, сдвигают их профили скорости, а также случайные изменения ориентации во время их миграции 10 . В описываемом протоколе мы описываем рабочий процесс для успешной электропорации и подготовки культуры среза 12 мозга мыши, а также временную конфокальную визуализацию культур срезов кортикального слоя.
Protocol
Representative Results
Discussion
Радиальная миграция является ключевым процессом развития неокортекса. Мутации в генах, влияющих на различные этапы этого процесса, могут вызывать сильные корковые пороки развития, в том числе гетеросексуальность lissencephaly и белого вещества 1 , 2 . Недавно м…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Жаклин Андрашко, Елену Верле, Сачи Такенаку и Маттиаса Тобера за отличную техническую помощь, а также Виктора Тарабикина за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft для SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
