Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em> Em Utero</em> Electroporação
Summary
Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.
Abstract
A eletroporação in utero é uma abordagem rápida e poderosa para estudar o processo de migração radial no córtex cerebral do desenvolvimento de embriões de ratos. Ele ajudou a descrever os diferentes passos da migração radial e caracterizar os mecanismos moleculares que controlam esse processo. Para analisar de forma direta e dinâmica os neurônios migratórios, eles devem ser rastreados ao longo do tempo. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que combina in utero eletroporação com cultura de fatias organotípicas e imagens confocais temporizadas, o que permite um exame direto e análise dinâmica de neurônios corticais de migração radial. Além disso, é possível caracterizar detalhadamente neurônios migratórios, como velocidade de migração, perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação radial. O método pode ser facilmente adaptado para realizar análises funcionais de genes de interesse em neurônios corticais de migração radial por perda e ganho de função, bem como experiências de resgate. Espaço de tempoA imagem dos neurônios migratórios é uma técnica de última geração que, uma vez estabelecida, é uma ferramenta potente para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral em modelos de ratos de transtornos de migração neuronal.
Introduction
O neocórtex é o principal site de funções cognitivas, emocionais e sensório-motoras. É composto de seis camadas horizontais orientadas em paralelo à superfície do cérebro. Durante o desenvolvimento, as células progenitoras na parede lateral do telencefalo dorsal dão origem a neurônios de projeção que migram radialmente para a superfície do pial e adquirem uma identidade neuronal específica do tipo de camada. Depois de serem geradas nas zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ), esses neurônios se tornam transitoriamente multipolar e diminuem sua migração. Após uma curta permanência na zona intermediária (IZ), eles mudam para uma morfologia bipolar, se prende ao andaime radial e continuam a migração orientada radialmente para a placa cortical (CP). Ao atingir o objetivo final, os neurônios de projeção se separam dos processos de glial radiais e adquirem identidade específica da camada. Mutações em genes que afetam diferentes etapas da migração neuronal podem causar malformação cortical grave, como lissencHematopia de IFF ou de matéria branca 1 , 2 .
A eletroporação in utero é uma técnica rápida e poderosa para transfectar células progenitoras neurais no cérebro em desenvolvimento de embriões de roedores 3 , 4 . Com esta técnica, é possível derrubar e / ou sobre-expressar genes de interesse para estudar suas funções no desenvolvimento de neurônios. Este método ajudou especificamente a descrever os detalhes morfológicos e a caracterizar os mecanismos moleculares do processo de migração radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Os neurônios de migração radial sofrem alterações dinâmicas na forma celular, velocidade de migração, bem como direção migratória, que requerem observação direta e contínua ao longo do tempo. Cultivo de fatias organotípicasA imagem confocal re e time-lapse de cérebros eletroporados permite observar diretamente os neurônios migratórios ao longo do tempo. Usando essa abordagem combinada, é possível analisar características distintas de neurônios migratórios que não podem ser investigados em seções de tecido fixo de cérebros eletroporados.
Recentemente, aplicamos imagens confocais de lapso de tempo de neurônios migratórios em culturas de fatia de cérebros eletroporados para estudar o papel do fator de transcrição CLL / linfoma 11a (Bcl11a) durante o desenvolvimento cortical 10 . Bcl11a é expressa em jovens neurônios corticais migratórios e utilizamos um alelo Bcl11a condicional condicional ( Bcl11a flox ) 11 para estudar suas funções. A eletroporação da recombinase Cre juntamente com a proteína fluorescente verde (GFP) em progenitores corticais dos cérebros BCL11a flox / flox nos permitiu criar uma situação de mutante de mosaico, na qual apenas algumas células são mutadas em umaDe outra forma, tipo selvagem. Desta forma, foi possível estudar as funções autônomas celulares de Bcl11a no nível de célula única. Descobrimos que os neurônios mutantes Bcl11a exibem velocidade reduzida, mudanças em seus perfis de velocidade, bem como mudanças de orientação aleatórias durante a migração 10 . No protocolo delineado, descrevemos um fluxo de trabalho para a eletroporação bem sucedida e preparação de cultura de fatia 12 de cérebros de mouse, bem como imagens confocais de lapso de tempo de culturas de fatia cortical.
Protocol
Representative Results
Discussion
A migração radial é um processo chave no desenvolvimento do neocórtex. As mutações em genes que afetam diferentes etapas deste processo podem causar malformações corticais graves, incluindo hepatite lissencefálica e heterotopia de matéria branca 1 , 2 . Recentemente, mostramos que Bcl11a, que é expressa em jovens neurônios de projeção cortical migratória, desempenha um papel na migração radial. Utilizamos imagens confocais de lapso de tempo de n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka e Matthias Toberer por uma excelente assistência técnica, bem como por Victor Tarabykin para discussões úteis. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
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