胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em>ウテロの</em>エレクトロポレーション
Summary
このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。
Abstract
子宮内でエレクトロポレーションは、発生中のマウス胚の大脳皮質における放射状移動のプロセスを研究するための迅速かつ強力なアプローチである。これは、半径方向移動の異なるステップを記述し、このプロセスを制御する分子メカニズムを特徴付けるのに役立っている。マイニングするニューロンを直接的かつ動的に分析するためには、時間の経過とともに追跡されなければならない。このプロトコールは、 子宮内のエレクトロポレーションと器官型のスライス培養および経時的な共焦点画像化を組み合わせたワークフローを記述しており、放射状に移動する皮質ニューロンの直接的検査および動的分析が可能である。さらに、移動速度、速度プロファイル、および半径方向の変化など、移動するニューロンの詳細な特徴付けが可能である。本方法は、救助実験と同様に、喪失および機能獲得によって、放射状に移動する皮質ニューロンにおける目的の遺伝子の機能的分析を行うために容易に適合させることができる。時間経過移動ニューロンの画像化は、かつて確立された最先端技術であり、ニューロン移動障害のマウスモデルにおける大脳皮質の発達を研究するための有力なツールである。
Introduction
新皮質は、認知機能、感情機能、および感覚運動機能の主要な部位である。それは、脳の表面に平行に向けられた6つの水平な層で構成されています。発達中、背側終脳の外側壁の前駆細胞は、突起表面に放射状に移動し、層タイプ特異的なニューロンの同一性を獲得する突起ニューロンを生じる。心室/脳室区域（VZ / SVZ）で生成された後、これらのニューロンは過渡的に多極となり、移動を遅らせる。中間ゾーン（IZ）に短時間滞在した後、両極性モルフォロジーに切り替え、放射状グリア骨格に付着させ、皮質プレート（CP）への放射状配向移行を続ける。最終的な標的投影に到達すると、ニューロンは、放射状グリアプロセスから分離し、層特有の同一性を獲得する。ニューロン移動の異なる段階に影響を与える遺伝子の突然変異は、リッスンなどの重度の皮質奇形を引き起こし得るephalyまたは白質heterotopia 1、2。
子宮内エレクトロポレーションではげっ歯類の胚3、4の脳の発達に神経前駆細胞をトランスフェクトするために迅速かつ強力な手法です。この技術により、発達中のニューロンにおけるそれらの機能を研究するために、目的の遺伝子をノックダウンおよび/または過剰発現させることが可能である。この方法は、具体的には、形態学的な詳細を説明し、半径方向の移動5、6、7、8、9のプロセスの分子機構を特徴づけるために役立っています。放射状に移動するニューロンは、細胞の形状、移動速度、および移動方向の動的変化を経るが、時間の経過とともに直接的かつ連続的な観察が必要である。オルガノタイプのスライスカルチャーエレクトロポレーションされた脳の再構成および経時的共焦点画像化は、経時的に移動するニューロンを直接観察することを可能にする。この組み合わされたアプローチを使用して、エレクトロポレーションされた脳の固定された組織切片において調査することができない、移動するニューロンの明確な特徴を分析することが可能である。
私たちは最近、皮質発達中の転写因子B細胞CLL /リンパ腫11a（Bcl11a）の役割を研究するために、エレクトロポレーションされた脳のスライス培養における移動ニューロンの時間経過共焦点画像化を適用した10 。 Bcl11aは、若い移動する皮質ニューロンにおいて発現され、その機能を研究するために条件付き突然変異Bcl11a対立遺伝子（ Bcl11a flox ） 11を使用した。緑色蛍光タンパク質（GFP）とともにCreリコンビナーゼをBcl11a flox / flox脳の皮質前駆細胞に電気穿孔することにより、モザイク変異体の状況を作り出した。そうでなければ野生型の背景。このようにして、単一細胞レベルでBcl11aの細胞自律機能を研究することが可能であった。我々は、 Bcl11a突然変異体ニューロンが、移動中の速度の低下、速度プロファイルの変化、およびランダムな向きの変化を示すことを見出した10 。概説されたプロトコールでは、マウス脳のエレクトロポレーションおよびスライス培養調製12の成功のワークフローならびに皮質切片培養の経時的共焦点画像化を記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
放射状移動は、新皮質発達における重要なプロセスである。このプロセスの異なる工程に影響を与える遺伝子の変異は、滑脳症と白質heterotopia 1、2を含む重篤な皮質奇形を引き起こす可能性があります。我々は最近、若い移動する皮質突起ニューロンにおいて発現されるBcl11aが、放射状移動において役割を果たすことを示した。我々は、エレクトロ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはJacqueline Andratschke、Elena Werle、Sachi Takenaka、Matthias Tobererに優れたテクニカル・アシスタンス、そしてVictor Tarabykinに有益な議論をしてくれたことに感謝します。この作業は、Deutsche ForschungsgemeinschaftのSB（BR-2215）への助成によって支えられました。
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
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