Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em> In Utero</em> Elektroporation
Summary
Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.
Abstract
In utero Elektroporation ist eine schnelle und leistungsstarke Ansatz, um den Prozess der radialen Migration in der Hirnrinde der Entwicklung von Maus Embryonen zu studieren. Es hat dazu beigetragen, die verschiedenen Schritte der radialen Migration zu beschreiben und die molekularen Mechanismen zu charakterisieren, die diesen Prozess kontrollieren. Um die Migrationsneuronen direkt und dynamisch zu analysieren, müssen sie im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der in der utero- Elektroporation mit organotypischer Schichtkultur und zeitraffer konfokaler Bildgebung kombiniert, die eine direkte Untersuchung und dynamische Analyse von radial wandernden kortikalen Neuronen ermöglicht. Darüber hinaus ist eine detaillierte Charakterisierung von Migrationsneuronen wie Migrationsgeschwindigkeit, Geschwindigkeitsprofilen sowie radiale Orientierungsänderungen möglich. Die Methode kann leicht angepasst werden, um funktionelle Analysen von Genen von Interesse bei der radialen Migration von kortikalen Neuronen durch Verlust und Gewinn der Funktion sowie Rettungsexperimente durchzuführen. ZeitrafferDie Bildgebung von Migrationsneuronen ist eine hochmoderne Technik, die einstmals ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Entwicklung der Hirnrinde bei Mausmodellen von neuronalen Migrationsstörungen ist.
Introduction
Der Neocortex ist der Hauptort der kognitiven, emotionalen und sensomotorischen Funktionen. Es besteht aus sechs horizontalen Schichten, die parallel zur Oberfläche des Gehirns ausgerichtet sind. Während der Entwicklung führen die Vorläuferzellen in der lateralen Wand des dorsalen Telencephalons zu Projektion Neuronen, die radial in Richtung der Pial Oberfläche wandern und erwerben eine Schicht Typ-spezifische neuronale Identität. Nachdem sie in den ventrikulären / subventrikulären Zonen (VZ / SVZ) erzeugt wurden, werden diese Neuronen vorübergehend multipolar und verlangsamen ihre Migration. Nach einem kurzen Aufenthalt in der Zwischenzone (IZ) wechseln sie zu einer bipolaren Morphologie, befestigen sie an dem radialen Gliagerüst und setzen eine radial orientierte Migration in die Kortikalplatte (CP) fort. Bei Erreichen ihrer endgültigen Zielprojektion lösen sich Neuronen von den radialen Gliaprozessen und erwerben schichtspezifische Identität. Mutationen in Genen, die verschiedene Schritte der neuronalen Migration beeinflussen, können zu schweren kortikalen Fehlbildungen führen, wie zB lissencEphalie oder weiße Substanz Heterotopie 1 , 2 .
In utero Elektroporation ist eine schnelle und leistungsstarke Technik, um neuronale Vorläuferzellen in das sich entwickelnde Gehirn der Nagetierembryonen 3 , 4 zu transfizieren. Mit dieser Technik ist es möglich, Gene zu knüpfen und / oder zu überexprimieren, um ihre Funktionen bei der Entwicklung von Neuronen zu untersuchen. Diese Methode hat gezielt dazu beigetragen, die morphologischen Details zu beschreiben und die molekularen Mechanismen des Prozesses der radialen Migration zu charakterisieren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radial wandernde Neuronen unterliegen dynamischen Veränderungen in der Zellform, Migrationsgeschwindigkeit und Migrationsrichtung, die eine direkte und kontinuierliche Beobachtung über die Zeit erfordern. Organotypische ScheibenkulturRe und zeitraffer konfokale bildgebung von elektroporierten Gehirnen erlauben es, die migrierenden Neuronen im Laufe der Zeit direkt zu beobachten. Mit diesem kombinierten Ansatz ist es möglich, verschiedene Merkmale von migrierenden Neuronen zu analysieren, die nicht in festen Gewebeabschnitten von elektroporierten Gehirnen untersucht werden können.
Wir wendeten kürzlich Zeitraffer konfokale Bildgebung von Neuronen in Kulturen von slice elektroporiert Gehirnen wandernde die Rolle des Transkriptionsfaktors B – Zell CLL / Lymphom 11a (BCL11A) während des kortikalen Entwicklung 10 zu studieren. Bcl11a wird in jungen, migrierenden kortikalen Neuronen ausgedrückt und wir verwendeten ein bedingtes mutiertes Bcl11a- Allel ( Bcl11a flox ) 11 , um seine Funktionen zu studieren. Die Elektroporation von Cre-Rekombinase zusammen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) in kortikale Progenitoren von Bcl11a- Flox- / Flox- Gehirnen ermöglichte es uns, eine Mosaikmutanten-Situation zu schaffen, in der nur wenige Zellen in einem mutiert sindSonst Wildtyp Hintergrund. Auf diese Weise war es möglich, zell-autonome Funktionen von Bcl11a auf Einzelzellenebene zu untersuchen. Wir fanden, dass Bcl11a- Mutanten-Neuronen reduzierte Geschwindigkeit, Verschiebungen in ihren Geschwindigkeitsprofilen sowie zufällige Orientierungsänderungen während ihrer Migration zeigen 10 . In dem skizzierten Protokoll beschreiben wir einen Workflow für eine erfolgreiche Elektroporation und Slice-Kultur-Präparation 12 von Maus-Gehirnen sowie eine zeitliche Konfokale Bildgebung von kortikalen Scheibenkulturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Radiale Migration ist ein wichtiger Prozess in der Neocortex-Entwicklung. Mutationen in Genen, die verschiedene Schritte dieses Prozesses beeinflussen, können schwere kortikale Fehlbildungen verursachen, einschließlich Lissencephalie und weiße Substanz Heterotopie 1 , 2 . Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Bcl11a, das in jungen wandernden kortikalen Projektion Neuronen ausgedrückt wird, eine Rolle bei der radialen Migration spielt. Wir haben die konfokale Bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka und Matthias Toberer für hervorragende technische Unterstützung sowie Victor Tarabykin für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von einem Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft an SB (BR-2215) unterstützt.
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
