Time-lapse Confocal Imaging av Migrating Neurons i Organotypic Slice Kultur av Embryonic Mouse Brain Using<em> I Utero</em> Elektroporasjon
Summary
Denne protokollen gir instruksjoner for direkte observasjon av radialt migrerende kortikale nevroner. I utero- elektroporasjon, organotypisk skivekultur og tidsforskjellende konfokal imaging kombineres for å direkte og dynamisk studere effekten av overekspresjon eller nedregulering av genene av interesse for migrerende nevroner og å analysere deres differensiering under utvikling.
Abstract
I utero elektroporasjon er en rask og kraftig tilnærming til å studere prosessen med radial migrasjon i hjernebarken for å utvikle musembryoer. Det har bidratt til å beskrive de ulike trinnene med radial migrasjon og karakterisere molekylære mekanismer som styrer denne prosessen. For å analysere migrerende nevroner direkte og dynamisk må de spores over tid. Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt som kombinerer i utero- elektroporasjon med organotypisk skivekultur og tidsforskjellende konfokal bildebehandling, som muliggjør en direkte undersøkelse og dynamisk analyse av radialt migrerende kortikale nevroner. Videre er detaljert karakterisering av migrerende nevroner, for eksempel migrasjonshastighet, hastighetsprofiler, samt radiale orienteringsendringer, mulig. Metoden kan lett tilpasses for å utføre funksjonelle analyser av gener av interesse for radialt migrerende kortikale nevroner ved tap og gevinst for funksjon samt redningseksperimenter. Time-lapseImaging av migrerende nevroner er en toppmoderne teknikk som en gang opprettet er et kraftig verktøy for å studere utviklingen av hjernebarken i musemodeller av neuronal migrasjonsforstyrrelser.
Introduction
Neocortex er det viktigste stedet for kognitive, følelsesmessige og sensorimotoriske funksjoner. Den består av seks horisontale lag orientert parallelt med hjernens overflate. Under utvikling gir progenitorceller i lateralveggen til dorsaltelencephalon anledning til fremspringneuroner som migrerer radialt mot pialoverflaten og erverver en lagtype-spesifikk neuronal identitet. Etter å være generert i de ventrikulære / subventrikulære sonene (VZ / SVZ), blir disse nevronene transient multipolære og senker deres migrasjon. Etter et kort opphold i mellomsonen (IZ) bytter de til en bipolar morfologi, festes til den radiale glialstillasjen, og fortsetter radialt orienterte migrering i kortikalplaten (CP). Ved å nå deres endelige målprojeksjon, avtar nevroner seg fra de radiale glialprosessene og skaffer lagsspesifikke identiteter. Mutasjoner i gener som påvirker forskjellige trinn av nevronmigrasjon kan forårsake alvorlig kortikal misdannelse, som lissencEphaly eller white matter heterotopia 1 , 2 .
I utero elektroporasjon er en rask og kraftig teknikk for å transfektere nevrale stamceller i utviklingshjernen av gnagereembryoer 3 , 4 . Med denne teknikken er det mulig å knockdown og / eller overexpresse gener av interesse for å studere sine funksjoner i å utvikle nevroner. Denne metoden har spesielt bidratt til å beskrive de morfologiske detaljene og karakteriserer molekylære mekanismer i prosessen med radial migrasjon 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radialt migrerende nevroner gjennomgår dynamiske endringer i celleform, migrasjonshastighet, samt migreringsretning, som krever direkte og kontinuerlig observasjon over tid. Organotypisk skivekultusRe og time-lapse konfokal avbildning av elektroporerte hjerner tillater direkte observasjon av migrerende nevroner over tid. Ved hjelp av denne kombinerte tilnærmingen er det mulig å analysere forskjellige egenskaper hos migrerende nevroner som ikke kan undersøkes i faste vevseksjoner av elektroporerte hjerner.
Vi har nylig brukt konfokal imaging av migrerende nevroner i skivekulturer av elektroporerte hjerner for å studere rollen som transkripsjonsfaktor B-celle CLL / lymfom 11a (Bcl11a) under kortikal utvikling 10 . Bcl11a uttrykkes i unge migrerende kortikale nevroner, og vi brukte en betinget mutant Bcl11a allel ( Bcl11a flox ) 11 for å studere dens funksjoner. Elektroporering av Cre rekombinase sammen med grønt fluorescerende protein (GFP) i kortikale stamceller av Bcl11a flox / flox hjerner tillot oss å skape en mosaikkmutant situasjon, hvor bare få celler muteres i enEllers villtype bakgrunn. På denne måten var det mulig å studere celleautonomiske funksjoner av Bcl11a på enkeltcellens nivå. Vi fant at Bcl11a-mutantneuroner viser redusert hastighet, endringer i deres hastighetsprofiler, samt tilfeldige orienteringsendringer under deres migrasjon 10 . I den skisserte protokollen beskriver vi en arbeidsflyt for vellykket elektroporasjon og skivekulturpreparasjon 12 av mushjerner, samt tidsforskjellende konfokal bildebehandling av kortikale skivekulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Radial migrasjon er en sentral prosess i utvikling av neocortex. Mutasjoner i gener som påvirker forskjellige trinn i denne prosessen, kan forårsake alvorlige kortikale misdannelser, inkludert lissensfalisering og hvite substans heterotopia 1 , 2 . Vi viste nylig at Bcl11a, som uttrykkes i unge migrerende kortikale projeksjonsneuroner, spiller en rolle i radiell migrasjon. Vi brukte tidsforskjellende konfokal bildebehandling av migrerende nevroner i akutte kor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka og Matthias Toberer for utmerket teknisk assistanse, samt Victor Tarabykin for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 신경과학. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
