عزل وزراعة كارديوميوسيتيس الفئران الكبار
Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لعزل وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك). يمكن استخدام أرفك معزولة لزراعة قصيرة وطويلة الأجل. عزل وزراعة أرفك يمكن أن تلعب دوراً رئيسيا في تطوير نظم المعالجة الجديدة لأمراض القلب.
Abstract
في قلب سليمة، وتأثير الخلايا المجاورة cardiomyocytes الكبار. مع طريقة العزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار، إجراء تحقيق دقيق لسلوك هذه الخلايا ضمن بيئات وعلاجات محددة أمر ممكن. ويعرض هذه المخطوطة بروتوكول لعزل ناجحة وزراعة cardiomyocytes البطين الفئران الكبار (أرفك).
هو التضحية بالفئران بخلع عنق الرحم تحت التخدير العميق. ثم، يتم استخراج القلب والشريان الاورطي كشف. وفي وقت لاحق، يتم نضح على نظام التروية لانجيندورف مع نضوب الكالسيوم والعلاج كولاجيناز. بعد ذلك، أنسجة البطين يحصل مفروم، إعادة توزيع، وتصفيتها، تليها ثلاث خطوات استخدام الطرد المركزي مع الإضافة التدريجية كاكل2 حتى يتم التوصل إلى تركيز الكالسيوم الفسيولوجية. يتم مطلي أرفك في خلية ثقافة الأطباق. بعد تحديث مستنبت الخلية، أرفك يمكن أن تزرع لمدة تصل إلى ستة أيام دون تغيير وسيلة الثقافة التي تحتوي على المصل. عزل أرفك عملية حساسة كالسيوم. التغييرات الصغيرة في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا يسبب نقصان في الجودة والسلامة للخلايا المعزولة.
أرفك على شكل قضيب طازجة معزولة. في الأيام الأولى للزراعة فإنها تفقد على شكل قضيب مورفولوجيا ونموذج pseudopodia مثل هياكل (نشر). خلال هذا التكوين المورفولوجي أرفك في البداية تتحلل عناصرها الهوس متبوعاً إصلاح عن طريق ألياف الأكتين الإجهاد و حيثياته ساركوميروجينيسيس. بعد أسبوع واحد من زراعة، تظهر معظم أرفك مظهر على نطاق واسع مع سترييشن عبر وضوح قابلة للاكتشاف. هذه العملية حساسة لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا، كما يخفف العلاج مع إيونوميسين نشر. هي علامات رئيسية في هذه العملية دي وإعادة ديفيرينتييشن β-الميوسين سلسلة ثقيلة (β-MHC) و oncostatin م (OSM) سويبروسين-1 (EFHD2). وأشارت الدراسات الأخيرة أن القلب re ودو ديفيرينتييشن التي تحدث في ظروف الثقافة يحاكي ميزات ينظر في فيفو أثناء إعادة عرض القلب. ولذلك، عزل وزراعة أرفك تلعب دوراً أساسيا في فهم بيولوجيا كارديوميوسيتيس.
Introduction
كارديوميوسيتيس الكبار في فيفو العمل سينسيتيوم كهربائية استناداً إلى خلية خلية الاتصالات بين ميوسيتيس. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي تتأثر بالخلايا المجاورة مثل القلب الليفية والخلايا البطانية والخلايا العصبية والخلايا الملتهبة1. من أجل دراسة قدرة كارديوميوسيتيس على التكيف مع تلك المنظمة داخل الخلايا لتغيير ظروف الحمل، كما رأينا خلال تضخم القلب، الذي هو خطوة أولية مما يؤدي إلى قصور القلب، والعزلة وزراعة الفئران البطين الكبار كارديوميوسيتيس (أرفك) هو اللازمة2،،من34. تاريخيا، كانت أولاً cardiomyocytes معزولة من الفرخ الجنينية قلوب5،6. بضع سنوات في وقت لاحق، وصفت الأولى عزل cardiomyocytes الميؤوس من شفائهم المتباينة باستخدام الكالسيوم استنفاد7. بيد أن هذه كارديوميوسيتيس الكبار لم تكن الكالسيوم متسامح ولذلك لا يمكن استخدامها لفحوصات فنية. وأخيراً، تمكين بروتوكول جديد في عام 1976 بأول وتطور التحقيق في cardiomyocytes البطين الكبار تحت الظروف الفسيولوجية8. وكخطوة أولى، أنها معزولة cardiomyocytes الكبار تحت تركيزات منخفضة من الكالسيوم والكالسيوم بعد ذلك زيادة التركيزات الفسيولوجية في إجراء التدرجي. اليوم، معظم البروتوكولات لعزل وزراعة كارديوميوسيتيس الكبار يعمل بهذا البروتوكول الكالسيوم واستخدام كولاجيناز الهضم الأنزيمي من اتصالات كثيفة خلية-خلية1.
زراعة ناجحة، مطلوب مصل العجل الجنين (FCS) أو oncostatin م (OSM). أرفك أداء دي-وإعادة-differentiation مع تغييرات هيكلية واسعة النطاق بما في ذلك ساركومير التفكيك واصلاحهم9،10،،من1112. هذه العملية هو مصحوبا بتعبير إعادة جينات نوع الجنين، مثل سلسلة ثقيلة β-الميوسين (β-MHC)، كما يعرف من تضخم، وتشكيل هياكل مثل بسيودوبوديا، وتسمى أيضا نشر4،11، 13-وعلاوة على ذلك، سويبروسين-1 (EFHD2)، بروتين محددة حديثا، دوراً رئيسيا عملية التفريق بين إعادة زراعتها أرفك11. نتيجة لذلك أرفك في ثقافة تحويل الخلايا على نطاق واسع، والأشكال التي تظهر تقلصات تلقائية بعد أسبوعين أو ثلاثة أسابيع في الثقافة2،،من414.
الاكتشافات الأخيرة قد كشفت عن أن القلب re ودو differentiation كما يحدث في ظروف الثقافة يقلد الميزات ينظر في فيفو خلال القلب يعيد10،15. إعادة عرض القلب عملية رئيسية خلال أمراض القلب16. كما لا تزال أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في المجتمعات الصناعية، من المهم فهم أفضل لبيولوجيا cardiomyocytes الكبار (الذين؛ عام 2015). عزل وزراعة أرفك يمكن أن تساعد على وضع استراتيجيات جديدة وأدوية لعلاج أمراض القلب. ويرد مع هذه المخطوطة، بروتوكولا لعزل وزراعة أرفك. وعلاوة على ذلك، سلط الضوء على بعض الأجزاء الهامة من هذا الأسلوب في جزء المناقشة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتأثر سلوك cardiomyocytes الكبار في فيفو بكثير من التفاعلات مع خلايا أخرى (مثلاً، الخلايا العصبية، خلايا بطانية، والخلايا الليفية، الخلايا الملتهبة) وسينسيتيوم الكهربائية التي تشكل1. ولذلك يتطلب دراسة التكيف مع الإجهاد من كارديوميوسيتيس الكبار حصرا بالعزلة وزراعة أرفك. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون نادين ويتاسكي وبيتر فولك للمساعدة التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يشكر المؤلفون السيدة كلوديا لورينز (الكاتب الطبية، أكسيديس) لمساعدتها في إعداد المخطوطة. هذه المخطوطة كانت تدعمها ماليا DFG (شلو 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
