Isolatie en teelt van volwassen ratten Cardiomyocytes
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en de teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC). Geïsoleerde ARVC kan worden gebruikt voor de teelt van korte en lange termijn. De isolatie en de teelt van ARVC kunnen spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van nieuwe behandeling regimes voor hartziekten.
Abstract
In een intact hart invloed op aangrenzende cellen volwassen cardiomyocytes. Met de methode van isolatie en teelt van volwassen cardiomyocytes is een nauwkeurig onderzoek van het gedrag van deze cellen onder specifieke behandelingen en omgevingen mogelijk. Dit manuscript presenteert een protocol voor succesvolle isolatie en teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC).
De rat wordt opgeofferd door cervicale dislocatie onder diepe verdoving. Vervolgens het hart wordt geëxtraheerd en de aorta wordt blootgelegd. Perfusie op het Langendorff perfusie systeem met calcium uitputting en collagenase behandeling wordt vervolgens uitgevoerd. Daarna, ventriculaire weefsel krijgt gehakt, opnieuw verspreid, en gefilterd, gevolgd door drie centrifugeren stappen met geleidelijke toevoeging van CaCl2 totdat fysiologische calcium concentratie wordt bereikt. ARVC zijn vergulde op cel cultuur gerechten. Na het vernieuwen van het kweekmedium cel, mag ARVC worden verbouwd tot maximaal zes dagen zonder het kweekmedium serum-bevattende. Isolatie van ARVC is een calcium-gevoelige proces. Kleine veranderingen in de concentratie van intracellulair calcium leiden tot een afname van de kwaliteit en de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen.
Vers geïsoleerd ARVC zijn staaf vormige. In de eerste dagen van de teelt van verliezen ze de staafvormig morfologie en formulier pseudopodia-achtige structuren (spreiding). Tijdens deze morfologische formatie degraderen ARVC aanvankelijk hun contractiele elementen, gevolgd door een Reformatie door middel van actine stress vezels en DOVO sarcomerogenesis. Na een week van teelt, meeste ARVC Toon een wijdverbreide verschijning met een duidelijk waarneembare kruis strepen. Dit proces is gevoelig voor de concentratie van intracellulair calcium, zoals behandeling met ionomycin verspreiden verzwakt. Belangrijke markeringen in dit proces van de – en re – differentiation zijn β-myosin zware ketting (β-MHC), oncostatin M (OSM), en swiprosin-1 (EFHD2). Recente studies hebben gesuggereerd dat cardiale re – en de – differentiation onder cultuuromstandigheden voorkomende functies gezien in vivo tijdens het remodelleren van de cardiale nabootst. Daarom, isolatie en teelt van ARVC spelen een sleutelrol in het begrip van de biologie van cardiomyocytes.
Introduction
Werken als een elektrische syncytium op basis van cel-cel contacten tussen myocytes volwassen cardiomyocytes in vivo . Bovendien, worden zij beïnvloed door aangrenzende cellen zoals cardiale fibroblasten, endotheliale cellen en neuronen ontstekingscellen1. Om te bestuderen van de mogelijkheid van cardiomyocytes aan te passen hun intracellulaire organisatie gewijzigd beladingstoestanden, zoals gezien tijdens de hypertrofie van het hart, die een eerste stap leidt tot hartfalen, de isolatie en de teelt van volwassen ventriculaire ratten cardiomyocytes (ARVC) is nodig2,3,4. Historisch, waren cardiomyocytes eerst geïsoleerd uit embryonale chick harten5,6. Een paar jaar later, werd de eerste isolatie van terminaal gedifferentieerde cardiomyocytes beschreven met behulp van calcium uitputting7. Echter is deze volwassen cardiomyocytes waren niet calcium tolerant en kan daarom niet worden gebruikt voor functionele testen. Ten slotte, in 1976 een nieuw protocol ingeschakeld Powell en Twist te onderzoeken van volwassen ventriculaire cardiomyocytes onder fysiologische omstandigheden8. Als een eerste stap geïsoleerd ze volwassen cardiomyocytes onder lage calcium concentraties en daarna verhoogd calcium aan fysiologische concentraties in een stapsgewijze procedure. Vandaag meeste protocollen voor het isoleren en de teelt van volwassen cardiomyocytes werk met dit protocol calcium en collagenase gebruiken voor de enzymatische vertering van de dichte cel contacten1.
Voor een succesvolle teelt is foetaal kalfsserum (FCS) of oncostatin M (OSM) vereist. ARVC uitvoeren een de – en re – differentiation met uitgebreide structurele veranderingen, met inbegrip van de Sarcomeer demontage en Reformatie9,10,11,12 Dit proces gaat gepaard met een nieuwe expressie van genen die foetale-type, zoals β-myosin zware ketting (β-MHC), zoals bekend van hypertrofie, en een vorming van pseudopodia-achtige structuren, een afkorting voor verspreiding4,11, 13. Voorts swiprosin-1 (EFHD2), een nieuw geïdentificeerde eiwit, speelt een belangrijke rol in het proces van re differentiatie van gekweekte ARVC11. Dientengevolge, ARVC in cultuur transformeren in grootschalige, polymorfe cellen, waaruit spontaan weeën na twee tot drie weken in cultuur2,4,14.
Recente ontdekkingen hebben onthuld dat cardiale re – en de – differentiation zoals het gebeurt onder de kweekomstandigheden nabootsers functies gezien in vivo tijdens cardiale remodelleert10,15. Cardiale remodelleren is een belangrijke proces tijdens hartziekten16. Zoals hartziekten nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak in de geïndustrialiseerde samenlevingen zijn, een beter begrip van de biologie van volwassen cardiomyocytes is belangrijk (die; 2015). Isolatie en teelt van ARVC kunnen helpen bij het ontwikkelen van nieuwe strategieën en medicijnen voor de behandeling van hartziekten. Met dit manuscript, wordt een protocol voor het isoleren en de teelt van ARVC geleverd. Bovendien, sommige kritieke onderdelen van deze methode zijn gemarkeerd in de sectie discussie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gedrag van volwassen cardiomyocytes in vivo wordt beïnvloed door veel interacties met andere cellen (bijvoorbeeld, neuronen, endotheliale cellen, fibroblasten, ontstekingscellen) en de elektrische syncytium die zij vormen1. Bestuderen van stress aanpassing van volwassen cardiomyocytes uitsluitend, vereist daarom het isolement en de teelt van ARVC. De belangrijkste gevolgen van isoleren en het cultiveren van ARVC zijn: 1) verbreekt van extracellulaire matrix en cel-cel contac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Nadine Woitasky en Peter Volk voor technische bijstand. Bovendien, danken de auteurs mevrouw Claudia Lorenz (medische schrijver, ACCEDIS) voor haar hulp bij de voorbereiding van het manuscript. Dit manuscript werd financieel ondersteund door DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
