절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

Summary

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

Abstract

그대로 마음에 인접 한 셀 성인 cardiomyocytes 영향. 격리의 방법 및 성인 cardiomyocytes의 경작, 및 특정 환경에서 이러한 셀의 동작의 정확한 조사 가능 하다. 이 원고는 성공적인 격리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제공합니다.

쥐 자 궁 경부 전위 깊은 마 취에 의해 희생 이다. 그런 다음 심장 추출 되 고 대동맥 적용 되지 않습니다. 그 후, 관류 칼슘 소모와 콜라 치료 Langendorff 관류 시스템에서 수행 됩니다. 나중에, 심 실 조직 되 면 다진, 다시 유통, 필터링, 생리 적인 칼슘 농도 도달할 때까지 점진적 추가 CaCl₂ 3 원심 분리 단계 뒤. ARVC 셀 문화 요리에 도금 된다. 세포 배양 후, ARVC 수 재배 최대 6 일 동안 혈 청에 포함 된 문화 매체를 변경 하지 않고. ARVC의 격리 칼슘 민감한 과정 이다입니다. 세포내 칼슘 농도 있는 작은 변화 일으킬 품질 및 고립 된 세포의 생존 능력에 있는 감소.

갓 절연 ARVC 막대 모양입니다. 재배의 첫 번째 일 이내 그들은 손실 막대 모양의 형태와 양식 pseudopodia 같은 구조 (확산). 이 형태 형성 동안 ARVC는 처음 이어서 걸 스트레스 섬유와 드 노 보 sarcomerogenesis 통해 개혁 그들의 수축 성 요소 저하. 재배의 1 주일 후 대부분 ARVC 명확 하 게 감지 크로스 줄무늬와 광범위 한 모습을 보여줍니다. 이 과정은 ionomycin와 치료 약하게 확산으로 세포내 칼슘 농도에 민감 하다. 이 과정을의 드-하 고 다시-differentiation 키 표식은 β myosin 무 겁 사슬 (β-MHC), oncostatin M (OSM), 및 swiprosin-1 (EFHD2) 있습니다. 최근 연구는 심장 개장 동안 기능 본 vivo에서 모방 심장 다시 de differentiation 발생 문화 조건 하에서 제안 했다. 따라서, 절연 및 ARVC의 재배 cardiomyocytes의 생물학 이해에 중요 한 역할을 재생 합니다.

Introduction

Vivo에서 성인 cardiomyocytes는 전기 syncytium myocytes 사이 셀 연락처를 기반으로 작동 합니다. 또한, 그들은 심장 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 세포, 염증 세포¹같은 인접 한 세포에 의해 영향을 받습니다. 초기 단계를 선도 하 고 심장 마비, 분리와 성인 심 실 쥐의 심장 비 대, 동안 본 부하 조건 변경 cardiomyocytes의 능력을 그들의 세포내 조직 적응을 공부 하기 위하여 cardiomyocytes (ARVC)는 필요한^2,,34. 역사적으로, cardiomyocytes가 했다 미 발달 병아리 마음^5,6에서 격리 된 처음. 몇 년 후, 말기 차별화 cardiomyocytes의 첫 번째 절연 칼슘 고갈⁷을 사용 하 여 설명 했다. 그러나, 이러한 성인 cardiomyocytes 칼슘 허용 되었고 따라서 하지 사용 될 수 있는 기능 분석 실험. 마지막으로, 1976 년에 새로운 프로토콜 활성화 파월과 트위스트 생리 조건⁸에서 성인 심 실 cardiomyocytes 조사. 첫 번째 단계로 서, 그들은 낮은 칼슘 농도 및 생리 적인 농도 단계적 절차에서 그 후 증가 칼슘 성인 cardiomyocytes 고립. 오늘, 분리와 성인 cardiomyocytes의 재배에 대 한 대부분의 프로토콜이 칼슘 프로토콜을 사용 하 고 조밀한 셀 연락처¹의 효소 소화에 콜라를 사용 합니다.

성공적인 재배 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 oncostatin M (OSM)가 필요 합니다. ARVC 수행는 데-그리고 다시-differentiation sarcomere 해체와 개혁^9,10,,1112를 포함 하 여 광범위 한 구조 변경 합니다. Β-myosin 무거운 체인 (β-MHC) 처럼 태아 형 유전자의 재 식이이 과정 동반 비, 및 pseudopodia 같은 구조, 퍼지는^4,11, 이라고의 형성에서 알려진 ¹³. swiprosin-1 (EFHD2), 새로 확인된 된 단백질 재배 ARVC¹¹의 재 분화는 주요 역할을 수행 하는 또한. 그 결과, ARVC 문화에 광범위 하 게, 다형성 셀 문화^2,4,14에서 2 ~ 3 주 후 저절로 수축을 표시 하는 변환.

최근의 발견을 심장 다시 de differentiation 모방 문화 조건 하에서 발생 하는 대로 본 기능 vivo에서 심장 개장^10,15동안 밝혀졌다. 개장 하는 심장 심장 질환¹⁶동안 핵심 과정 이다. 심장 질환은 여전히 산업화 사회에서 죽음의 주요 원인, 성인 cardiomyocytes의 생물학의 더 나은 이해 중요 하다 (누가, 2015). 절연 및 ARVC의 새로운 전략 및 심장 질환의 치료에 대 한 의약품 개발을 도울 수 있다. 이 원고와 분리와 ARVC의 재배에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 또한,이 방법의 몇 가지 중요 한 부분 토론 섹션에서 강조 표시 됩니다.

Protocol

조사 관리 및 사용의 실험실 동물은 미국 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 의해 출판에 대 한 가이드에 따라 실시 됩니다. 일반적으로, 남성 wistar 쥐 3 ~ 4 개월을 세 고 250-350 g의 평균 무게와 더불어이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다. 한 쥐 마음은 20 문화 요리에 대 한 충분 한 (접시 당 1 mL; 내부 직경: 35mm) 10 4 셀/1000 m m 2 x 1.5의 대략적인 셀 밀도와. …

Representative Results

문화에서 성인 cardiomyocytes: 그림 1 마지막 세척 후 갓 절연된 성인 cardiomyocytes 2 h에 대 한 개요를 보여 줍니다. 모든 cardiomyocytes의 약 75%는 막대 모양의 형태를 했다. 나머지 25%는 둥근 형태와 전혀 감지 그대로 세포 막 (그림 1) 특이 한 모습을 보여주었다. 최대 재배 (6 일)의 끝에 pseudopodia 같은 구조 없이 둥근 형태에 …

Discussion

성인 cardiomyocytes에 vivo에서 의 행동은 다른 셀 (예:신경 세포, 내 피 세포, 섬유 아 세포, 염증 세포)와 그들이 형성 하는 전기 syncytium 많은 상호 작용에 의해 영향을¹. 따라서, 성인 cardiomyocytes의 스트레스 적응을 독점적으로 공부 해야 분리와 ARVC의 재배 합니다. 분리 하 고 ARVC를 재배의 주요 효과: 1) 기질과 셀 연락처;에서 그들을 분리 2) 수축 자극;에서 그들을 분리 3…

Materials

Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177