Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC). ARVC aislada puede utilizarse para el cultivo de corto y largo plazo. El aislamiento y cultivo de ARVC pueden desempeñar un papel clave en el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para enfermedades cardíacas.
Abstract
En un corazón intacto, las células adyacentes influyen en cardiomiocitos adultos. Con el método de aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos, es posible una investigación precisa del comportamiento de estas células en tratamientos específicos y ambientes. Este manuscrito presenta un protocolo para acertado aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC).
La rata se sacrificaron mediante dislocación cervical bajo anestesia profunda. A continuación, se extrae el corazón y la aorta se destapa. Posteriormente, se realiza la perfusión en el sistema de perfusión de Langendorff con el agotamiento de calcio y tratamiento de la colagenasa. Luego, tejido ventricular obtiene picada, recircula y filtrado, seguido de tres pasos de centrifugación con incorporación gradual de CaCl2 hasta que se alcanza la concentración fisiológica de calcio. ARVC se platean en platos de cultivo celular. Después de actualizar el medio de cultivo celular, ARVC pueden cultivar hasta seis días sin cambiar el medio de cultivo que contiene el suero. Aislamiento de ARVC es un proceso sensible del calcio. Pequeños cambios en la concentración de calcio intracelular provocar una disminución en la calidad y viabilidad de las células aisladas.
Recién aislado ARVC son en forma de barra. En los primeros días de cultivo pierden las forma morfología y forma seudópodos-como las estructuras (separarse). Durante esta formación morfológica ARVC degradan inicialmente sus elementos contráctiles seguidas por una reforma a través de fibras de actina estrés y sarcomerogenesis de novo . Después de una semana de cultivo, la mayoría ARVC muestran un aspecto generalizado con una estriación transversal claramente perceptible. Este proceso es sensible a la concentración de calcio intracelular, como tratamiento con ionomycin atenúa separarse. Los marcadores claves en este proceso de – y re – differentiation son cadena pesada de miosina β (β-MHC), Oncostatina M (OSM) y swiprosin-1 (EFHD2). Estudios recientes han sugerido que cardiaco re y de differentiation que ocurre bajo condiciones de cultivo imita características vistos en vivo durante la remodelación cardiaca. Por lo tanto, el aislamiento y cultivo de ARVC juegan un papel clave en la comprensión de la biología de cardiomiocitos.
Introduction
Cardiomiocitos adultos en vivo funciona como un sincitio eléctrico basado en los contactos célula-célula entre miocitos. Además, están influenciadas por las adyacentes células como fibroblastos cardíacos, células endoteliales, neuronas y células inflamatorias1. Con el fin de estudiar la capacidad de cardiomiocitos para adaptar su organización intracelular alterado condiciones de carga, como se ve durante la hipertrofia cardiaca, que es un paso inicial hacia la insuficiencia cardíaca, el aislamiento y cultivo de rata adulta ventricular cardiomiocitos (ARVC) es necesario2,3,4. Históricamente, cardiomiocitos primero fueron aislados de chick embrionario corazones5,6. Unos años más tarde, el primer aislamiento de cardiomiocitos terminalmente diferenciadas fue descrito por medio del agotamiento de calcio7. Sin embargo, estos cardiomiocitos adultos no eran tolerantes de calcio y por lo tanto no se podían utilizar para ensayos funcionales. Finalmente, en 1976 un nuevo protocolo permitió a Powell y toque investigar cardiomiocitos ventriculares adultos bajo condiciones fisiológicas8. Como primer paso, aislaron cardiomiocitos adultos bajo concentraciones bajas de calcio y posteriormente aumento calcio a concentraciones fisiológicas en un procedimiento paso a paso. Hoy, mayoría de los protocolos para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos trabaja con este protocolo de calcio y uso de colagenasa para la digestión enzimática de la célula densa contactos1.
Para un exitoso cultivo, suero fetal de ternero (FCS) u Oncostatina M (OSM) se requiere. ARVC realizar un de – y re – differentiation con extensos cambios estructurales incluyendo sarcómero desmontaje y reforma9,10,11,12. Este proceso es acompañado por una nueva expresión de los genes de tipo fetal, como la cadena pesada de miosina β (β-MHC), como la hipertrofia y formación de seudópodos-como las estructuras, también llamado extensión de4,11, 13. Además, swiprosin-1 (EFHD2), una proteína recientemente identificada, desempeña un papel importante en el proceso de rediferenciación de ARVC cultivadas11. Como resultado, ARVC en cultura se transforman en células generalizadas, polimorfas, que espontáneamente muestran contracciones después de dos a tres semanas de cultura2,4,14.
Recientes descubrimientos han revelado que cardiaca differentiation re y de como ocurre bajo condiciones de cultivo imita características vistos en vivo durante la remodelación cardiaca10,15. Remodelación cardiaca es un proceso clave en enfermedades cardíacas16. Enfermedades cardíacas siguen siendo la principal causa de muerte en las sociedades industrializadas, una mejor comprensión de la biología de cardiomiocitos adultos es importante (que; 2015). Aislamiento y cultivo de ARVC pueden ayudar a desarrollar nuevas estrategias y medicamentos para el tratamiento de enfermedades cardíacas. Con este manuscrito, se proporciona un protocolo para el aislamiento y cultivo de ARVC. Además, se destacan algunas partes esenciales de este método en la sección de discusión.
Protocol
Representative Results
Discussion
El comportamiento de los cardiomiocitos adultos en vivo está influenciado por muchas interacciones con otras células (p. ej., neuronas, células endoteliales, fibroblastos, células inflamatorias) y el sincicio eléctrico que forman1. Por lo tanto, estudiando la adaptación de la tensión de cardiomiocitos adultos exclusivamente requiere el aislamiento y cultivo de ARVC. Los principales efectos de aislar y cultivar ARVC son: 1) desconexión de la matriz extracelular y célula-c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores gracias Nadine Woitasky y Peter Volk para asistencia técnica. Además, los autores agradecen a la Sra. Claudia Lorenz (médico escritor, ACCEDIS) por su ayuda en la preparación del manuscrito. Este manuscrito fue apoyado financieramente por DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
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