Isolamento e cultivo de rato adulto Cardiomyocytes
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC). ARVC isolado pode ser usado para o cultivo de curto e longo prazo. O isolamento e cultivo da ARVC podem desempenhar um papel chave no desenvolvimento de novos esquemas de tratamento para doenças cardíacas.
Abstract
Em um coração intacto, células adjacentes influenciam cardiomyocytes adulto. Com o método de isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes, uma investigação precisa do comportamento dessas células sob ambientes e tratamentos específicos é possível. Este manuscrito apresenta um protocolo para a bem sucedido isolamento e cultivo de rato adulto cardiomyocytes ventricular (ARVC).
O rato é sacrificado por deslocamento cervical sob anestesia profunda. Então, é extraído o coração e a aorta é descoberta. Posteriormente, a perfusão do sistema de perfusão de Langendorff com depleção de cálcio e tratamento de colagenase é executada. Depois, tecido ventricular Obtém picado recirculado e filtrado, seguido por três etapas de centrifugação com adição gradual de CaCl2 até que seja alcançada a concentração de cálcio fisiológica. ARVC são banhados em pratos de cultura de células. Após atualizar o meio de cultura celular, ARVC pode ser cultivada por até seis dias sem alterar o meio de cultura contendo soro. Isolamento da ARVC é um processo sensível de cálcio. Pequenas alterações da concentração de cálcio intracelular causar uma diminuição na qualidade e viabilidade das células isoladas.
Recentemente isolado ARVC são em forma de haste. Nos primeiros dias de cultivo, eles perdem os bacilares morfologia e forma pseudópodos estruturas (espalhar). Durante esta formação morfológica ARVC inicialmente degradar seus elementos contráteis, seguidos por uma reforma através de fibras de estresse de actina e sarcomerogenesis de novo . Após uma semana de cultivo, a maioria ARVC mostrar uma aparência generalizada com uma faixa transversal claramente detectável. Este processo é sensível à concentração de cálcio intracelular, como tratamento com ionomycin atenua a propagação. Marcadores chaves neste processo de – e re – differentiation são cadeia pesada de miosina-β (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2). Estudos recentes têm sugerido que cardíaca re e de differentiation ocorrendo em condições de cultura imita características visto na vivo durante a remodelação cardíaca. Portanto, isolamento e cultivo da ARVC desempenham um papel chave na compreensão da biologia dos cardiomyocytes.
Introduction
Cardiomyocytes adulto na vivo funciona como um sincício elétrico baseado em contatos de celular entre myocytes. Além disso, eles são influenciados por células adjacentes como cardíacos fibroblastos, células endoteliais, neurônios e células inflamatórias1. Para estudar a capacidade dos cardiomyocytes para adaptar sua organização intracelular para alterou as condições de carga, como visto durante a hipertrofia cardíaca, que é um passo inicial levando a insuficiência cardíaca, o isolamento e cultivo de adulto rato ventricular cardiomyocytes (ARVC) é necessário2,3,4. Historicamente, cardiomyocytes primeiro foram isoladas de garota embrionárias corações5,6. Alguns anos mais tarde, o primeiro isolamento de cardiomyocytes terminalmente diferenciada foi descrito por meio de depleção de cálcio7. No entanto, esses adultos cardiomyocytes não eram tolerantes de cálcio e, portanto, não podiam ser utilizados para os ensaios funcionais. Finalmente, em 1976, um novo protocolo habilitado Powell e torcer para investigar adulto cardiomyocytes ventricular sob condições fisiológicas8. Como primeiro passo, isolaram cardiomyocytes adulto sob concentrações baixas de cálcio e cálcio posteriormente aumentado para concentrações fisiológicas em um processo gradual. Hoje, a maioria dos protocolos para isolamento e cultivo de adultos cardiomyocytes trabalharcom com este protocolo de cálcio e usam colagenase para a digestão enzimática da célula-célula densa contatos1.
Para um cultivo bem sucedido, é necessário soro fetal bezerro (FCS) ou oncostatin M (OSM). ARVC executar um de – e re – differentiation extensas alterações estruturais, incluindo o sarcômero desmontagem e reforma9,10,11,12. Este processo é acompanhado por uma re-expressão de genes fetais-tipo, como β-miosina de cadeia pesada (MHC-β), como conhecido de hipertrofia e uma formação de pseudópodos-como estruturas, também chamado de espalhamento4,11, 13. Além disso, swiprosin-1 (EFHD2), uma proteína recém identificada, desempenha um papel importante no processo de re-diferenciação de cultivada ARVC11. Como resultado, ARVC na cultura transformar-se em células generalizadas, polimórficas, que mostram espontaneamente contrações após duas a três semanas em cultura2,4,14.
Descobertas recentes têm revelado que cardíaca differentiation re e de como ocorre em condições de cultura imita possui visto na vivo durante cardíaca remodelação10,15. Remodelação cardíaca é um processo chave durante doenças cardíacas16. Como doenças cardíacas ainda são a principal causa de morte nas sociedades industrializadas, uma melhor compreensão da biologia da cardiomyocytes adulto é importante (quem; 2015). Isolamento e cultivo da ARVC podem ajudar a desenvolver novas estratégias e medicamentos para o tratamento de doenças cardíacas. Com este manuscrito, é fornecido um protocolo para o isolamento e cultivo da ARVC. Além disso, algumas partes críticas deste método são destacadas na seção de discussão.
Protocol
Representative Results
Discussion
O comportamento do adulto cardiomyocytes na vivo é influenciado por muitas interações com outras células (por exemplo, os neurônios, células endoteliais, fibroblastos, células inflamatórias) e o sincício elétrico que formam1. Portanto, estudar a adaptação de estresse de adultos cardiomyocytes exclusivamente requer o isolamento e cultivo da ARVC. Os principais efeitos de isolar e cultivar ARVC são: 1) desconectá-los de matriz extracelular e contatos do celular; 2) de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores graças a Nadine Woitasky e Peter Volk para assistência técnica. Além disso, os autores graças a Sra. Claudia Lorenz (médico escritor, ACCEDIS) por sua ajuda na preparação do manuscrito. Este manuscrito foi apoiado financeiramente pelo DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
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