Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.
Abstract
In einem intakten Herzen beeinflussen benachbarte Zellen adulten Kardiomyozyten. Mit der Methode der Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten ist eine genaue Untersuchung des Verhaltens dieser Zellen unter bestimmten Behandlungen und Umgebungen möglich. Diese Handschrift enthält ein Protokoll für erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC).
Die Ratte ist durch zervikale Dislokation Tiefe Narkose geopfert. Dann, das Herz wird extrahiert und die Aorta ist aufgedeckt. Anschließend wird die Perfusion auf dem Langendorff Perfusion System mit Kalzium Erschöpfung und Kollagenase-Behandlung durchgeführt. Danach bekommt ventrikuläre Gewebe gehackt, wieder in Umlauf gebracht, und gefiltert, gefolgt von drei Zentrifugation Schritte mit allmählicher Zugabe von CaCl2 bis physiologischer Calcium-Konzentration erreicht ist. ARVC sind beschichtet, auf Zelle Kultur Gerichte. Nach dem Aktualisieren der Zellkulturmedium, können ARVC kultiviert bis zu sechs Tage lang ohne Änderung der Serum-haltigen Kulturmedium. Isolierung von ARVC ist ein Kalzium sensibler Prozess. Kleine Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration führen eine Abnahme in der Qualität und Rentabilität der isolierten Zellen.
Frisch isolierte ARVC Rod geformt sind. In den ersten Tagen des Anbaus verlieren sie die stabförmige Morphologie und Form Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung). Während dieser morphologischen Bildung ARVC zunächst verschlechtern ihre kontraktile Elemente, gefolgt von einer Reformation durch Aktin Stress Fasern und de Novo Sarcomerogenesis. Nach einer Woche des Anbaus die meisten ARVC zeigen eine weit verbreitete Erscheinung mit einem eindeutig nachweisbar Kreuz Streifenbildung. Dieser Prozess ist empfindlich auf intrazellulären Calcium-Konzentration, wie Behandlung mit Ionomycin Ausbreitung vermindert. Wichtigsten Marker in diesem Prozess der de – und re – differentiation sind β-Myosin heavy Chain (β-MHC), Oncostatin M (OSM) und Swiprosin-1 (EFHD2). Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass kardiale Re und de differentiation Auftritt unter Kulturbedingungen Funktionen gesehen in Vivo bei kardialen remodeling imitiert. Isolierung und Kultivierung ARVC spielen daher eine Schlüsselrolle für das Verständnis der Biologie der Herzmuskelzellen.
Introduction
Adulten Herzmuskelzellen in Vivo Arbeit als eine elektrische Synzytien nach Zell-Zell-Kontakten zwischen Myozyten. Darüber hinaus werden sie von benachbarten Zellen wie kardialen Fibroblasten, Endothelzellen, Neuronen und Entzündungszellen1beeinflusst. Um die Fähigkeit der Kardiomyozyten Anpassung ihrer intrazellulären Organisation zu studieren verändert Lastbedingungen, wie gesehen in Herzhypertrophie, die ein erster Schritt zur Herzinsuffizienz, die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen ventrikuläre Ratte führt Herzmuskelzellen (ARVC) ist notwendig2,3,4. In der Vergangenheit wurden Kardiomyozyten zunächst isoliert von embryonalen Küken Herzen5,6. Wenige Jahre später, wurde die erste Isolierung der unheilbar differenzierter Herzmuskelzellen mit Kalzium Erschöpfung7beschrieben. Allerdings diese adulten Kardiomyozyten waren nicht Kalzium tolerant und daher nicht für funktionelle Assays verwendet werden konnten. Schließlich, im Jahr 1976 ein neues Protokoll aktiviert Powell und Twist Erwachsenen ventrikuläre Herzzellen unter physiologischen Bedingungen8zu untersuchen. Als ersten Schritt isoliert sie Erwachsene Herzzellen unter niedrigen Kalzium-Konzentrationen und danach erhöhte Kalzium zu physiologischen Konzentrationen in einem schrittweisen Verfahren. Heute die meisten Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten arbeiten mit diesem Kalzium-Protokoll und Kollagenase für die enzymatische Verdauung von dichten Zell-Zell Kontakte1verwenden.
Für einen erfolgreichen Anbau ist fetalen Kälberserum (FCS) oder Oncostatin M (OSM) erforderlich. ARVC führen eine de – und re – differentiation mit umfangreichen strukturellen Veränderungen einschließlich Sarkomers Demontage und Reformation9,10,11,12. Dieser Prozess ist durch einen erneuten Ausdruck der fetalen Typ Gene, wie β-Myosin heavy Chain (β-MHC) begleitet, wie man von Hypertrophie und eine Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen, auch genannt Verbreitung4,11, 13. Darüber hinaus Swiprosin-1 (EFHD2), ein neu identifizierten Protein spielt eine wichtige Rolle bei der erneuten Differenzierung der kultivierten ARVC11. Infolgedessen ARVC in Kultur verwandeln sich in weit verbreiteten, polymorphe Zellen, die Kontraktionen spontan nach zwei bis drei Wochen in Kultur2,4,14zeigen.
Die jüngsten Entdeckungen haben gezeigt, dass kardiale Re und de differentiation wie sie unter Kulturbedingungen Mimik Auftritt gesehen in Vivo während kardiale Umbau10,15bietet. Kardialen remodeling ist ein Schlüsselprozess bei Herzkrankheiten16. Da Herzerkrankungen noch die häufigste Todesursache in den industrialisierten Gesellschaften sind, ist es wichtig, ein besseres Verständnis der Biologie der adulten Kardiomyozyten (wer, 2015). Isolierung und Kultivierung ARVC können helfen, um neue Strategien und Medikamente für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Mit diesem Manuskript ist ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ARVC zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden einige kritische Teile dieser Methode in die Diskussion Abschnitt hervorgehoben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Verhalten der Erwachsenen Herzzellen in Vivo ist beeinflusst durch viele Interaktionen mit anderen Zellen (z.B.Neuronen, Endothelzellen, Fibroblasten, Entzündungszellen) und die elektrischen Synzytien bilden sie1. Studium Stress Anpassung der adulten Kardiomyozyten ausschließlich erfordert daher, die Isolierung und Kultivierung ARVC. Die wichtigsten Auswirkungen der Isolierung und Kultivierung ARVC sind: 1) trennen sie von der extrazellulären Matrix und Zell-Zell Kontakte;…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Nadine Woitasky und Peter Volk für technische Hilfe. Darüber hinaus danken den Autoren für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Handschrift Frau Claudia Lorenz (medizinische Schriftsteller, ACCEDIS). Dieser Handschrift wurde finanziell unterstützt von der DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
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