Isolering och odling av vuxen råtta hjärtmuskelcellerna
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering och odling av vuxen råtta ventrikulära hjärtmuskelcellerna (ARVC). Isolerade ARVC kan användas för kort- och långsiktig odling. Isolering och odling av ARVC kan spela en nyckelroll i utvecklingen av nya behandlingsregimer för hjärtsjukdomar.
Abstract
I en intakt hjärta påverka intilliggande celler vuxen hjärtmuskelcellerna. Med metoden för isolering och odling av vuxen hjärtmuskelceller är en noggrann undersökning av beteendet hos dessa celler under specifika behandlingar och miljöer möjligt. Detta manuskript presenterar ett protokoll för framgångsrika isolering och odling av vuxen råtta ventrikulära hjärtmuskelcellerna (ARVC).
Råttan offras av cervikal dislokation under djup anestesi. Sedan hjärtat utvinns och aorta är avtäckt. Därefter utförs perfusion på systemet av perfusion med kalcium utarmning och kollagenas behandling. Efteråt, ventrikulär vävnad får malet, återcirkuleras, och filtreras, följt av tre centrifugering steg med gradvis tillsats av CaCl2 tills fysiologiska kalciumkoncentration uppnås. ARVC är pläterade på cell kultur rätter. Efter uppfriskande i cellodlingsmedium, kan ARVC odlas upp till sex dagar utan att ändra odlingssubstratet som innehåller serum. Isolering av ARVC är en känslig process som kalcium. Små förändringar i den intracellulära kalcium koncentrationen orsaka en minskning av den kvalitet och hållbarhet av isolerade celler.
Nymalen isolerade ARVC är stången formad. Inom de första dagarna av odling förlorar de stavformade morfologi och form pseudopodia-liknande strukturer (spridning). Under denna morfologiska formation ARVC initialt försämra deras kontraktila element följt av en reformation genom aktin stress fibrer och de novo sarcomerogenesis. Efter en vecka av odling, de flesta ARVC visar en utbredd utseende med en klart påvisbar cross strimmor. Denna process är känsliga för intracellulär kalciumkoncentration, som behandling med ionomycin dämpar spridning. Viktiga markörer i denna process av de – och re – differentiation är β-myosin heavy chain (β-MHC), oncostatin M (OSM) och swiprosin-1 (EFHD2). Nyligen genomförda studier har föreslagit att hjärt re – och de – differentiation uppstår under kultur härmar funktioner ses i vivo under hjärt remodeling. Därför, isolering och odling av ARVC spela en nyckelroll i att förstå biologin av hjärtmuskelceller.
Introduction
Adult hjärtmuskelcellerna i vivo fungerar som en elektrisk syncytium baserat på cell-cell kontakter mellan myocyter. Dessutom påverkas de av angränsande celler som hjärt fibroblaster, endotelceller, nervceller och inflammatoriska celler1. För att studera hjärtmuskelcellerna förmåga att anpassa organisationen intracellulära till ändrats belastning förhållanden, som sett under hjärthypertrofi, som ett första steg leder till hjärtsvikt, isolering och odling av vuxen ventrikulära råtta hjärtmuskelcellerna (ARVC) är nödvändiga2,3,4. Historiskt, isolerades hjärtmuskelceller först från embryonala chick hjärtan5,6. Några år senare, beskrevs den första isoleringen av terminalt differentierade hjärtmuskelcellerna med hjälp av kalcium utarmning7. Dock dessa vuxna hjärtmuskelcellerna var inte kalcium tolerant och därför inte kunde användas för funktionella analyser. Ett nytt protokoll aktiverad slutligen, 1976 Powell och Twist att undersöka vuxna ventrikulära hjärtmuskelcellerna under fysiologiska betingelser8. Som ett första steg isolerade de vuxen hjärtmuskelcellerna under låg kalcium koncentrationer och därefter ökad kalcium till fysiologiska koncentrationer i ett stegvis förfarande. Idag, de flesta protokoll för isolering och odling av vuxen hjärtmuskelcellerna arbetar med detta kalcium protokoll och använda kollagenas för enzymatisk nedbrytning av tät cell-cell kontakter1.
För en lyckad odling krävs fetalt kalvserum (FCS) eller oncostatin M (OSM). ARVC utföra en de – och re – differentiation med omfattande strukturella förändringar inklusive sarcomere demontering och reformationen9,10,11,12. Denna process åtföljs som av ett nytt uttryck av fostrets-typen gener, som β-myosin heavy chain (β-MHC), känd från hypertrofi och ett bildande av pseudopodia-liknande strukturer, som också kallas fördelande4,11, 13. Dessutom swiprosin-1 (EFHD2), ett nyligen identifierade protein, spelar en viktig roll i processen re differentiering av odlade ARVC11. Som ett resultat, förvandla ARVC i kultur till utbredd, polymorf celler, som spontant visar sammandragningar efter två till tre veckor i kultur2,4,14.
Senaste upptäckter har visat att hjärt re – och de – differentiation som det inträffar under odlingsbetingelser härmar har sett i vivo under hjärt remodeling10,15. Hjärt remodeling är en viktig process under hjärtsjukdomar16. Hjärtsjukdomar är fortfarande den främsta dödsorsaken i industrialiserade samhällen, en bättre förståelse av biologin av vuxen hjärtmuskelcellerna är viktigt (som, 2015). Isolering och odling av ARVC kan bidra till att utveckla nya strategier och läkemedel för behandling av hjärtsjukdomar. Med detta manuskript ges ett protokoll för isolering och odling av ARVC. Dessutom markeras vissa kritiska delar av denna metod i diskussionsavsnittet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beteendet hos vuxna hjärtmuskelcellerna i vivo påverkas av många interaktioner med andra celler (t.ex., nervceller, endotelceller, fibroblaster, inflammatoriska celler) och den elektriska syncytium som de utgör1. Därför kräver studera stress anpassning av vuxen hjärtmuskelcellerna uteslutande isolering och odling av ARVC. De huvudsakliga effekterna att isolera och odla ARVC är: 1) koppla bort dem från extracellulär matrix och cell-cell kontakter; (2) koppla bort dem fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Nadine Woitasky och Peter Volk för tekniskt bistånd. Dessutom tackar författarna Mrs. Claudia Lorenz (medicinsk författare, ACCEDIS) för hennes hjälp med att förbereda manuskriptet. Detta manuskript stöddes ekonomiskt av DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
