Yalıtım ve yetişkin fare Cardiomyocytes tarımı
Summary
Burada, yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı için bir iletişim kuralı mevcut. İzole R.V.C kısa ve uzun vadeli tarım için kullanılabilir. Yalıtım ve R.V.C ekimi kalp hastalıkları için yeni tedavi rejimlerinin geliştirilmesi önemli bir rol oynayabilir.
Abstract
Sağlam bir kalp içinde yetişkin cardiomyocytes bitişik hücreleri etkiler. Bu hücre spesifik tedaviler ve ortamları altında davranışının kesin bir soruşturma yalıtım yöntemi ve yetişkin cardiomyocytes ekimi ile mümkündür. Bu el yazması için bir protokolü başarılı yalıtım ve yetişkin fare Ventriküler cardiomyocytes (R.V.C) tarımı sunar.
Sıçan tarafından derin anestezi altında servikal çıkığı feda etti. O zaman, kalp çıkarılan ve aort damarı ortaya olduğunu. Daha sonra perfüzyon Langendorff perfüzyon sistemi kalsiyum azalması ve collagenase tedavi ile gerçekleştirilir. Daha sonra ventrikül doku kıyılmış, yeniden sirküle ve filtre, üç Santrifüjü adım CaCl2 kademeli eklenmesi ile fizyolojik kalsiyum konsantrasyonu ulaşılana kadar izledi. R.V.C hücre kültür yemekleri üzerinde kaplama. Hücre kültür orta yenilemeden sonra R.V.C altı güne kadar serum içeren kültür orta değiştirmeden ekili olabilir. R.V.C yalıtım kalsiyum hassas bir işlemdir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonu küçük değişiklikler kalite ve canlılığı izole hücrelerinin azalmasına neden.
Taze izole R.V.C çubuk şeklinde uygulanır. Ekimi ilk gün içinde (yayılan) çubuk şeklinde morfoloji ve form pseudopodia benzeri yapıları kaybediyorlar. Bu morfolojik oluşumu sırasında R.V.C başlangıçta bir reformasyon aktin stres lifleri ve de novo sarcomerogenesis ardından contractile öğelerini bozulmasına yol açar. Ekimi bir hafta sonra en R.V.C yaygın bir görünümü ile açıkça tespit çapraz striation göster. İonomycin ile tedavi yaymak zayıflar gibi bu hücre içi kalsiyum konsantrasyonu için hassas bir işlemdir. Bu süreçte, de – ve yeniden – differentiation anahtar işaretleri β-myosin ağır zincir (β-MHC), oncostatin M (OSM) ve swiprosin-1 (EFHD2) vardır. Son çalışmalarda kalp re ve de differentiation kültür koşullarda meydana gelen özellikler görüldü vivo içinde kalp tadilat sırasında taklit olduğunu düşündürmektedir. Bu nedenle, yalıtım ve R.V.C ekimi cardiomyocytes Biyoloji anlamada önemli bir rol oynar.
Introduction
Yetişkin cardiomyocytes in vivo hücre-hücre kişiler arasında miyositler dayalı bir elektrik syncytium olarak çalışıyorum. Buna ek olarak, kardiyak fibroblastlar, endotel hücreleri, sinir hücreleri ve inflamatuar hücre1gibi bitişik hücreleri tarafından etkilenmektedir. Cardiomyocytes onların hücre içi kuruluşa uyum yeteneği çalışma için iş yükü koşullarının, hangi bir ilk adım kalp yetmezliği, yalıtım ve yetişkin ventrikül sıçan tarımı için lider kalp hipertrofisi sırasında görüldüğü gibi değişmiş cardiomyocytes (R.V.C) gerekli2,3,4‘ tür. Tarihsel olarak, cardiomyocytes ilk embriyonik piliç kalpler5,6ile izole edildi. Birkaç yıl sonra ölümcül farklılaşmış cardiomyocytes ilk yalıtım kalsiyum azalması7kullanarak tanımlanmıştır. Ancak, bu yetişkin cardiomyocytes kalsiyum dayanıklı değildi ve bu nedenle işlev deneyleri için kullanılamadı. Son olarak, 1976 yılında Powell ve Twist yetişkin Ventriküler cardiomyocytes fizyolojik şartlarda8altında incelemek için yeni bir iletişim kuralı etkinleştirilmiş. İlk adım olarak, onlar yetişkin cardiomyocytes düşük kalsiyum konsantrasyonu ve kademeli bir yordam fizyolojik konsantrasyonları bundan sonra artan kalsiyum altında izole. Bugün, yalıtım ve yetişkin cardiomyocytes ekimi için çoğu protokoller bu kalsiyum protokolü ile iş ve yoğun hücre-hücre kişiler1Enzimatik sindirim için collagenase kullanın.
Başarılı bir tarım için fetal buzağı serum (FCS) veya oncostatin M (OSM) gereklidir. R.V.C gerçekleştirmek bir de – ve yeniden – differentiation sarcomere demontaj ve reformasyon9,10,11,12de dahil olmak üzere kapsamlı yapısal değişiklikler ile. Bu işlem türü fetal genlerin, β-myosin ağır zincir (β-MHC) gibi yeniden ifadeye göre hipertrofisi ve yayılan4,11, olarak da bilinir, pseudopodia benzeri yapıların oluşumu Bilindiği gibi eşlik ediyor 13. swiprosin-1 (EFHD2), yeni saptanan protein, Ayrıca, ekili R.V.C11yeniden farklılaşma sürecinde önemli bir rol oynar. Sonuç olarak, R.V.C kültür kendiliğinden kültür2,4,142-3 hafta sonra kasılmalar göstermek yaygın, polimorfik hücrelere dönüşümü.
Son keşifler taklit eder kültür koşullar altında gerçekleştiği sırada kalp re ve de differentiation görülen vivo içinde kalp remodeling10sırasında,15bulunduğunu ortaya çıkardı. Kardiyak remodeling anahtar işlemi sırasında kalp hastalıkları16‘ dır. Olarak kalp hastalıkları hala ölüm sanayileşmiş toplumlarda ana nedeni, Yetişkin cardiomyocytes Biyoloji daha iyi anlamak önemlidir (kim; 2015). Yalıtım ve R.V.C ekimi yeni stratejiler ve kalp hastalıklarının tedavisi için ilaç geliştirmek için yardımcı olabilir. Bu makale ile yalıtım ve R.V.C ekimi için bir protokol sağlanır. Ayrıca, bu yöntemin bazı kritik bölümleri tartışma bölümünde vurgulanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetişkin cardiomyocytes in vivo davranışını diğer hücreleri (örneğin, nöronlar, endotel hücreleri, fibroblastlar, inflamatuar hücreler) ve onlar oluşturan elektrik syncytium ile pek çok etkileşimler tarafından etkilenir1. Bu nedenle, Yetişkin cardiomyocytes uyarlaması stres sadece eğitim yalıtım ve R.V.C ekimi gerektirir. İzole ve R.V.C yetiştirilmesi ana etkileri: 1) kesmeden hücre dışı matriks ve hücre-hücre kişiler; 2) contractile uyaranlara kesme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Nadine Woitasky ve Peter Volk teknik yardım için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, yazarlar Bayan Claudia Lorenz (tıbbi yazar, ACCEDIS) yazının hazırlanmasında yardım için teşekkür ederiz. Bu el yazması mali DFG (Schlu 324/7-1) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -. D. . Cardiomyocytes – Active Players in Cardiac Disease. , (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -. D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. . Molecular biology of the cell. , (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
