Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Markus G&#246;tz; Philipp Wortmann; Sonja Schmid; Thorsten Hugel

doi:10.3791/56896

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Published: January 30, 2018

doi:

10.3791/56896

Markus Götz, Philipp Wortmann, Sonja Schmid², Thorsten Hugel

¹Institute of Physical Chemistry,University of Freiburg, ²Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول للحصول على بيانات ألوان سمفريت وتحليلها مع فرقة 3D نموذج ماركوف المخفي. مع هذا النهج، يمكن استخراج العلماء المعلومات الحركية من نظم البروتين المعقدة، بما في ذلك كوبيراتيفيتي أو التفاعلات المرتبطة.

Abstract

جزيء واحد فورستر الرنين نقل الطاقة (سمفريت) أصبحت تقنية الفيزيائية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة ديناميات الجزيئات الحيوية. للعديد من الأجهزة الجزيئية في بروتينات خلية يجب أن تعمل جنبا إلى جنب مع الشركاء التفاعل في دورة وظيفي إنجاز مهمتهم. التمديد اللونين إلى متعدد الألوان سمفريت يجعل من الممكن للتحقيق في وقت واحد أكثر من التفاعل أو تغيير كونفورماشونال. هذا ليس فقط يضيف بعدا جديداً إلى تجارب سمفريت ولكن كما يوفر إمكانية فريدة لمباشرة دراسة تسلسل الأحداث والكشف عن التفاعلات المرتبطة عند استخدام نموذج المعطل تداولها ومن الأسفار انعكاس داخلي الكلي مجهر (تيرفم). ولذلك، سمفريت متعدد الألوان أداة مرنة لدراسة المجمعات الجزيئية البيولوجية بطريقة كمية، وفي تفصيل سابقا لا يمكن تحقيقه.

هنا، نحن توضح كيفية التغلب على التحديات الخاصة لتجارب سمفريت متعدد الألوان على البروتينات. نقدم بروتوكولات مفصلة للحصول على البيانات واستخراج المعلومات الحركية. وهذا يشمل تتبع معايير الاختيار والفصل بين الدولة واستعادة مسارات الدولة من البيانات صاخبة باستخدام فرقة 3D نموذج ماركوف المخفي (هم). مقارنة بالأساليب الأخرى، المعلومات الحركية لا يتم استرداد من يسكن الوقت المدرج الإحصائي ولكن مباشرة من هم. إطار الحد الأقصى لاحتمال يسمح لنا لتقييم النموذج الحركي حاسمة وتوفير أوجه عدم اليقين ذات مغزى للمعدلات.

عن طريق تطبيق أسلوبنا لبروتين الصدمة الحرارة 90 (Hsp90)، نحن قادرون على تشابك الربط النوكليوتيدات والتغيرات العالمية كونفورماشونال من البروتين. وهذا يسمح لنا بمراقبة مباشرة كوبيراتيفيتي بين اثنين النوكليوتيدات ملزمة جيوب ديمر Hsp90.

Introduction

إنجاز العديد من البروتينات وظيفتها في مجمعات دينامية مع جزيئات أخرى، بوساطة التغيرات كونفورماشونال ورابطات عابرة على مجموعة واسعة من المقاييس الزمنية¹^،^،من²³. يقترن بمصدر الطاقة خارجي (مثل ATP) يمكن أن يؤدي إلى اتجاه في دورة وظيفي هذه التفاعلات الدينامية وفي النهاية الحفاظ على ثابت-حالة عدم التوازن في خلية، شرطا أساسيا للحياة.

أجل الفهم الكامل لهذه الآلات الجزيئية، وصف ثابتة يسترشد بدراسات الهيكلية غير كافية. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري الحصول على معرفة طراز الحركية الكامنة وتحديد الثوابت معدل الحركية. العديد من الأساليب القائمة السماح للباحثين بدراسة القوى المحركة للتفاعلات الثنائية بين اثنين من جزيئات الفائدة، مثلاً، السطحية مأكل مثل الطحين الرنين، وأساليب الاسترخاء مع قراءات الطيفية (مثلاً، القفز أو توقف تدفق تقنيات)، والرنين المغناطيسي النووي. ومع ذلك، قابليتها للتطبيق في معظم الحالات يقتصر على أنظمة الدولتين بسيطة (مثلاً، واحد محدد وإحدى الدول غير المنضمة) بسبب متوسط الملازمة للجزء الأكبر من التجارب. في الحالات التي تنطوي على مزيد من الدول أو وسيطة، أنها تعطي فقط خليط معقد من الثوابت معدل. يمكن استرداد طرق جزيء واحد مثل الملقط ضوئية أو مغناطيسية أو اللونين سمفريت و أي جهة مانحة و fluorophore يقبلون واحد، مع عينة المعطل تداولها سطح الثوابت معدل للجميع لاحظ التغييرات كونفورماشونال. ومع ذلك، عندما يتعلق الأمر بالتفاعلات التي تؤثر على موقع ربط واحد أو أكثر، هذه الأساليب لا تزال محدودة والمعلومات المتعلقة بالتفاعلات العلاقة المحتملة للاثنين (أو أكثر) سيكون متاحاً عن طريق الاستنتاجات غير المباشرة من مجموعة من التجارب فقط.

سمفريت متعدد الألوان⁴^،⁵^،^،من⁶⁷^،^،من⁸⁹ يتيح الفرصة لدراسة التفاعل بين هذه المكونات مباشرة، في الوقت الحقيقي، وتحت ¹⁰من شروط قرب الفسيولوجية. وهذا يسمح أحد للتحقيق على سبيل المثال، ربط تعتمد على تكيف يجند أو البروتين⁸^،^،من⁹¹¹. النهج العام للمقدمة هنا لتسمية protein(s) الفائدة في مواقف محددة، تعلق بروتين واحد على سطح الدائرة بالقياس، وتتبع شدة الأسفار على مر الزمن في تيرفم نوع المنشور (للتفاصيل انظر ⁹ ^, ¹²). يمكن تحديده بالقرب المكاني من صبغات مختلفة ثم من نقل الطاقة بين البلدين. تصنيف استراتيجيات تختلف من البروتين للبروتين (استعرض في ¹³) وتوجد مبادئ توجيهية لتجنب القطع الأثرية في القياسات سمفريت¹⁴.

منذ صبغة الجهات مانحة قد نقل الطاقة إلى الأصباغ يقبلون مختلفة في تجربة سمفريت متعدد ألوان، الموضع النسبي لجميع الأصباغ غير قابل للوصول من الإثارة لصبغ واحد وحدها¹⁵^،¹⁶. ولكن في تركيبة مع التناوب الإثارة الليزر (أليكس¹⁷، و استعرضت في ¹⁸) يوفر هذا الأسلوب جميع المعلومات الزمانية في الثانية الفرعية والقرار الفرعي نانومتر.

في رأس مال، حساب عالية الدقة يمكن أن يتحقق من المعلومات الهيكلية باستخدام المسافات بين صبغ من الجمع بين جميع الأسفار الكثافات في تجربة سمفريت متعدد ألوان مع أليكس. ومع ذلك، نركز هنا على تحديد هوية الدولة والانفصال، فضلا عن استخراج النماذج الحركية، حيث سمفريت متعدد الألوان أمر لا غنى عنه. عندما المطلوب هو “فقط” هيكل التصميم بالتثليث، مجموعة من التجارب سمفريت اللونين أبسط مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية يمكن أداء¹²^،¹⁹.

ونحن نستخدم fluorescence جزئي () كوكيل لنقل الطاقة بين اثنين فلوروفوريس⁷. PF يحسب من الأسفار كثافة مماثلة لكفاءة الحنق تجربة اللونين:

فيها، الكثافة في الانبعاثات قناة م بعد الإثارة مع اللون السابق، وهو ج يقبلون مع الطول الموجي الأطول. وتمثل قنوات الكشف عن نفس الموقف في الدائرة عينة ولكن سجل نطاقات طيفية مختلفة من الضوء الفلورية. يتم استخدام نفس المعرف للإثارة والانبعاثات في هذا البروتوكول (أي، “الأزرق”، “الخضراء”، و “أحمر”).

بسبب قصور تجريبية تعتمد كثافة fluorescence يقاس ليس فقط في نقل الطاقة ولكن أيضا على خصائص فلوروفوري والإعداد. بغية الحصول على كفاءة نقل الطاقة الحقيقية بين هذين فلوروفوريس، قد كثافات المقاسة ينبغي تصحيحها. يستند الإجراء التالي على المرجع⁹. عوامل التصحيح للتسرب الظاهر (lk، أي مكان مخصص للكشف عن الفوتونات من فلوروفوري في قناة لصبغ آخر) وغاما الظاهر (ag، أي العائد الكم الأسفار من الصبغة الكشف عن كفاءة القناة) تم الحصول عليها من آثار جزيء واحد تظهر يقبلون تبيض الحدث.

تسرب الصبغة المانحين في كل قناة يقبلون ممكن يتم حسابها من كافة نقاط البيانات في آثار fluorescence مسجل فيها مقصور صبغ يقبلون لكن الجهة المانحة لا تزال الفلورسنت ():

الوسيط للرسم البياني التسرب كعامل التسرب الظاهر. بعد التصحيح للتسرب، يتم تحديد معامل جاما الظاهر من نفس المجموعة من آثار. فإنه يحسب بقسمة تغير الأسفار في قناة يقبلون على التغيير للأسفار في قناة المانحين على تبييض لصبغ يقبلون:

حيث c هو مرة أخرى قناة كشف يقبلون مع الطول الموجي الأطول. الوسيط لتوزيع الناتج كعامل التصحيح الظاهر.

يتم الحصول على كثافة تصحيحها في كل قناة من:

ثم يتم حساب الجبهة الوطنية استناداً إلى:

يمكن فصل مختلف قطاعات السكان في الفضاء المتعدد الأبعاد موزعة حسب PFs. الموقف وعرض كل دولة يتحدد باحتواء البيانات مع وظائف الضبابي متعدد الأبعاد. التحسين اللاحقة من هم عالمي واحد استناداً إلى جميع آثار PF يوفر وصفاً كمياً للحركية الملحوظة. حتى التغيرات الصغيرة معدلات قابلة للاكتشاف.

هممس توفر طريقة لاستنتاج نموذج دولة من مجموعة من آثار الوقت صاخبة. هذا النظام يعتبر أن في واحدة من مجموعة منفصلة، الدول المخفية في أي وقت من الأوقات والمراقبة الفعلية (أي الانبعاثات) دالة احتمالية لهذه الدولة الخفية²⁰. في حالة البيانات سمفريت تيرفم، الانبعاثات الاحتمالات ب_أنا كل دولة وأنا يمكن أن تكون على غرار بوظائف مستمرة الكثافة الاحتمالية الضبابي. في نقاط زمنية منفصلة متباعدة بشكل منتظم، يمكن أن يحدث الانتقال من واحد إلى دولة أخرى وفقا لاحتمال انتقال الثابتة على الوقت ويعتمد فقط على الحالة الراهنة. مصفوفة الانتقال A يحتوي على هذه الاحتمالات الانتقال _ij بين جميع الدول المخفية. توزيع الدولة الأولى يعطي على الاحتمالات الخاصة بالدولة لأول مرة نقطة تتبع الوقت. استخدام نهج الحد الأقصى-احتمال، يمكن تحسين هذه المعلمات لأفضل وصف البيانات مع الأمام-للخلف واوم-ولش خوارزميات²⁰^،²¹. وهذا ينتج المقدرات الحد الأقصى لاحتمال (MLE). وأخيراً، يمكن الاستدلال على تسلسل الدولة التي أنتجت على الأرجح مسار الملاحظات مع خوارزمية Viterbi. خلافا لغيرها من التحليلات هم سمفريت البيانات²⁴^،^،من²⁵إلى²⁶ نحن لا نستخدم هم كمجرد “تجانس” من البيانات ولكن استخراج نموذج الدولة الحركية من مجموعة البيانات بدون الحاجة لتركيب الوقت يسكن ²⁷من رسوم بيانية. ويتم تحليل هم مع البرامج النصية الداخلية باستخدام برو إيغور. ويستند تنفيذ المدونة مرجع²¹. نحن توفير مجموعة البرمجيات والبيانات النموذجية على لدينا صفحة ويب كي تتبع القسمين 5 و 6 من هذا البروتوكول (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). البرنامج الكامل متاح عند الطلب.

الوقت النقاط في البيانات مع الجبهة الوطنية <-1 أو PF > يتم تعيين 2 في أي قناة الكشف عن احتمال انبعاث الحد الأدنى لجميع الدول (10^-200). وهذا ما يمنع التحولات المصطنعة في نقاط البيانات هذه.

يتم الحصول على المعلمات لاحتمالات الانبعاثات من تناسب الرسم البياني PF 3D مع وظائف الضبابي كما هو موضح في الخطوة 5، 7. وتحفظ هذه المعلمات ثابتة خلال الاستغلال الأمثل هم.

في النهج الذي قدم، تستخدم مصفوفة الانتقال وناقلات توزيع الدولة الأولى عالمياً لوصف فرقة كاملة من آثار. يتم تحديثها استناداً إلى جميع الجزيئات N من مجموعة البيانات وفقا لمرجعية²⁷.

يتم تحديد معلمات البدء لتوزيع الدولة الأولى من إسقاطات 2D من الرسم البياني PF (الخطوة 5، 3) واحتمالات الانتقال يتم تعيين إلى 0.05 استثناء الاحتمالات البقاء في الدولة نفسها، التي يتم اختيار هذه أن احتمال مغادرة دولة معينة هو تطبيع للوحدة.

يتم استخدام أسلوب تنميط احتمال إعطاء فواصل الثقة (رابطة الدول المستقلة) لكل مرحلة انتقالية معدلات²¹^،²²، التي تكون بمثابة تقديرات ذات مغزى لعدم اليقين. لحساب حدود كاريتاس الدولية لمعدل معين، هو ثابت احتمال انتقال الاهتمام إلى قيمة أخرى MLE. وهذا ينتج λ نموذج اختبار ‘. اختبار نسبة (LR) احتمال من احتمالات نظراً لمجموعة البيانات تتم 0 استناداً إلى:

الثقة 95% ملزمة للتوصل إلى المعلمة عندما يتجاوز LR 3.841، كانتيل 95% من س²-التوزيع مع واحد من²²^،درجة من الحرية²³.

هو أظهرت قوة الأسلوب باستخدام في Hsp90. هذا البروتين وفيرة وجدت في البكتريا، وحقيقيات النوى، وهو جزء من استجابة الإجهاد الخلوية²⁸. وهدف المخدرات واعدة في علاج السرطان²⁹. Hsp90 هوموديمير مع جيب ملزم النوكليوتيدات واحدة في المجال الطرفي ن لكل وحدة فرعية³⁰. أنه يمكن أن يخضع للتحولات بين اثنين على الأقل والتشكلات متميزة على الصعيد العالمي، واحدة مغلقة و أحد الطرفي ن تكيف مفتوحة، على شكل V،¹⁹^،³¹^،³². طبيعة dimeric مباشرة يثير مسألة التفاعل بين هذين الموقعين النوكليوتيدات ملزمة في Hsp90.

في ما يلي، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة للحصول على البيانات وتحليلها لتجربة ألوان سمفريت الخميرة Hsp90 والنوكليوتيدات. ربط تعتمد على تكيف PNP أمبير المسمى فلوريسسينتلي (PNP أمبير *، النظير غير هيدروليزابل من ATP) يتم تحليل. تطبيق الإجراء وصف تصاريح دراسة الربط النوكليوتيدات، وفي نفس الوقت التغييرات كونفورماشونال من Hsp90 ومما يكشف عن كوبيراتيفيتي بين اثنين النوكليوتيدات ملزمة جيوب Hsp90.

Protocol

1-الإعداد والشروط المسبقة إجراء القياسات سمفريت متعدد الألوان على تيرفم نوع المنشور. وصف إعداد اللونين كما يرد منشور جوف مرجع12. بناء تيرفم متعدد ألوان. بالتفصيل تخطيط عام في 9. استخدام التحويل، ضخ صمام ثنائي ليزر الحالة الصلبة موجات مستمرة، مما يغن…

Representative Results

تسمح القياسات سمفريت متعدد الألوان مباشرة الكشف عن العلاقة المتبادلة بين اثنين أو أكثر من مواقع التفاعل متميزة. وهذا يجعل التقنية فريدة من نوعها للتحقيق في نظم متعددة العناصر، مثل مجمعات البروتين. علينا أن نركز على عرض تجربة ألوان سمفريت هنا، هو بمثابة مثال توضيحي. <p cl…

Discussion

نقدم الإجراءات التجريبية للحصول على بيانات ألوان سمفريت لنظام معقد من بروتين، ووصف خطوة بخطوة لتحليل هذه القياسات. ويوفر هذا النهج إمكانية فريدة لتقييم العلاقة بين عدة مواقع التفاعل أو التغييرات conformational مباشرة.

من أجل الحصول على بيانات جزيء واحد متعدد الألوان مناسبة على ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وتمول هذا العمل مؤسسة البحوث الألمانية (أنست 39/969-1) ومجلس البحوث الأوروبية من خلال “منسق الإغاثة الطارئة المنحة” نون 681891.

Materials

Setup
vibration-damped optical table	Newport, Irvine, CA, USA	RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1196625
laser control unit	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1234465	Scientific Remote
aspheric telescope lenses	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 473/10	cleanup filter excitation
CF ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 532/10	cleanup filter excitation
CF ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 594/10	cleanup filter excitation
CF ex4	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	FL635-10	cleanup filter excitation
DM ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ594RDC	dichroic mirror excitation
DM ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	570DCXR	dichroic mirror excitation
DM ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ491RDC	dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis	AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA		high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP	piezosystem jena GmbH, Jena, Germany		Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper	Newport, Irvine, CA, USA	PZA12	PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses	Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany	G322-304-000	d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit	Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany	27.160.1212	max. aperture 12 x 12 mm
DM det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	T 600 LPXR	dichroic mirror detection
DM det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	H 560 LPXR superflat	dichroic mirror detection
DM det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	HC BS R635	dichroic mirror detection
BP det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	525/40 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	586/20 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	631/36 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det4	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	700/75 ET Bandpass	bandpass filter detection
optical shutters detection	Vincent Associates, Rochester, NY, USA	Uniblitz VS25S2T0
EMCCD iXon Ultra 897	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535	National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	PHD22/2000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow chamber
quartz slides	G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA		Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	1626W	10 x 12cm
spray adhesive	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	Photo Mount 050777
glycerol	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany	Immersol G
immersion oil	OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany	IMMOIL-F30CC
prism	Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany		Suprasil1
aluminium prism holder			custom built
hollow setscrews	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	2-4450	ACF00001
PTFE tubing	Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany	S1810-08
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin			UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550	ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*	Jena Bioscience, Jena, Germany		γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	F8764	amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Andor Solis	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland		version 4.30
LabVIEW	National Instruments, Austin, Texas, USA		version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software	AA Opto-Electronic, Orsay, France		version 2.03a
Coherent Connection	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA		version 3
Igor Pro	WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA		version 6.37

References

Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90’s mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
Fink, G. A. . Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).
Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).