Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Markus G&#246;tz; Philipp Wortmann; Sonja Schmid; Thorsten Hugel

doi:10.3791/56896

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Published: January 30, 2018

doi:

10.3791/56896

Markus Götz, Philipp Wortmann, Sonja Schmid², Thorsten Hugel

¹Institute of Physical Chemistry,University of Freiburg, ²Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology

Summary

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Abstract

Single-molecuul Förster resonance energieoverdracht (smFRET) is een veel gebruikte biofysische techniek te bestuderen van de dynamiek van biomoleculen geworden. Voor veel moleculaire machines in een cel eiwitten hebben om op te treden samen met partners van de interactie in een functionele cyclus te vervullen van hun taak. De uitbreiding van twee-kleur naar multi smFRET maakt het mogelijk om gelijktijdig sonde meer dan één interactie of conformationele verandering. Dit niet alleen voegt een nieuwe dimensie aan smFRET experimenten, maar het biedt ook de unieke mogelijkheid te rechtstreeks bestuderen de opeenvolging van gebeurtenissen en te detecteren gecorreleerde interacties bij gebruik van een geïmmobiliseerdet monster en een totale interne reflectie fluorescentie Microscoop (TIRFM). Daarom is Multi-Color smFRET een veelzijdig instrument voor het bestuderen van biomoleculaire complexen op een kwantitatieve manier en in een voorheen onhaalbaar detail.

We laten hier zien hoe te overwinnen van de bijzondere uitdagingen voor meerdere kleuren smFRET experimenten op eiwitten. Presenteren wij gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen van de gegevens en voor het extraheren van de kinetische gegevens. Het gaat hierbij om trace selectiecriteria, scheiding van staat en het herstel van de Braziliaanse trajecten van de luidruchtige gegevens met behulp van een 3D ensemble verborgen Markov Model (HMM). Vergeleken met andere methoden, is de kinetische gegevens niet hersteld van de nadruktijd tijd histogrammen, maar rechtstreeks vanuit de HMM. Het kader van maximale kans laat ons tot het kritisch evalueren de kinetische model en zinvolle onzekerheden voor de tarieven.

Door het toepassen van onze methode op de warmte schok eiwit 90 (Hsp90), kunnen we ontwarren van de nucleotide-bindende en de mondiale conformationele veranderingen van het eiwit. Dit kan we direct de Allosterie tussen de twee nucleotide-bindende zakken van de Hsp90-dimeer observeren.

Introduction

Veel eiwitten vervullen hun functie in dynamische complexen met andere moleculen, gemedieerd door conformationele veranderingen en voorbijgaande verenigingen over een brede waaier van tijdschalen¹^,²^,³. Gekoppeld aan een externe energiebron (bijvoorbeeld ATP) deze dynamische interacties kunnen leiden tot directionaliteit in een functionele cyclus en uiteindelijk het onderhouden van de niet-evenwichts steady-state in een cel, een voorwaarde voor het leven.

Om volledig te begrijpen deze moleculaire machines, is een statische beschrijving geleid door structurele studies niet voldoende. Daarnaast is het essentieel te beschikken over kennis van de onderliggende kinetische model en te bepalen van de kinetische snelheidsconstanten. Verschillende bestaande methoden toestaan onderzoekers bestuderen de dynamiek van binaire interacties tussen twee moleculen van belang, bijvoorbeeld oppervlakte plasmon resonantie, ontspanning methoden met een spectroscopische uitlezing (bijvoorbeeld sprong of gestopt-flow technieken), en nucleaire magnetische resonantie. Hun toepasbaarheid is echter in de meeste gevallen beperkt tot eenvoudige tweestaten-systemen (bijvoorbeeld een gebonden en een niet-afhankelijke staat) als gevolg van de gemiddeld die inherent zijn aan bulk experimenten. In gevallen waar meer Staten of tussenproducten zijn betrokken, opleveren zij alleen een complex mengsel van de snelheidsconstanten. Single-molecuul methoden zoals optische of magnetische pincet of twee kleuren smFRET, d.w.z. een donor en één acceptor fluorophore, met een oppervlak-geïmmobiliseerd steekproef kunnen de snelheidsconstanten herstellen voor alle conformationele wijzigingen waargenomen. Echter wanneer het gaat om interacties op het gebied van meer dan één binding site, deze methoden beperkt blijven en de informatie over de wisselwerkingen mogelijk correlatie van de twee (of meer) zal alleen bereikbaar zijn via indirecte conclusies uit een aantal experimenten.

Multi kleur smFRET⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹ biedt de mogelijkheid te bestuderen van de interactie tussen deze componenten direct, in real-time en onder in de buurt van de fysiologische omstandigheden¹⁰. Hierdoor kan een te onderzoeken bijvoorbeeld de conformatieafhankelijke binding van een ligand of een ander eiwit⁸^,–⁹^,¹¹. De hier gepresenteerde algemene benadering is om de expressie gebrachte eiwitten van belang op specifieke posities, één eiwit hechten aan het oppervlak van de meting-kamer, en het bijhouden van de intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd op een prisma-type TIRFM (voor details zie ⁹ label ^, ¹²). de ruimtelijke nabijheid van de verschillende kleurstoffen kan vervolgens worden bepaald uit de energie-overdracht tussen hen. Labelen van strategieën kan variëren van eiwit tot proteïne (herzien in ¹³) en richtsnoeren om te voorkomen dat artefacten in smFRET metingen bestaan¹⁴.

Aangezien de kleurstof van een donor energie in verschillende acceptor kleurstoffen in een multi kleur smFRET experiment overbrengen kan, is de relatieve positie van alle kleurstoffen niet toegankelijk vanaf excitatie van een kleurstof alleen¹⁵^,¹⁶. Maar deze methode biedt in combinatie met afwisselende laser excitatie (ALEX¹⁷en gerecenseerd in ¹⁸) alle spatio-temporele informatie bij sub tweede en sub nanometer resolutie.

In principe, hoge resolutie structurele informatie kan worden bereikt door gebruik te maken van de afstanden tussen kleurstof berekend op basis van de combinatie van alle fluorescentie intensiteiten in een multi kleur smFRET experiment met ALEX. Echter richten hier we ons op staat identificatie en scheiding, evenals de winning van kinetische modellen, waar meerdere kleuren smFRET onontbeerlijk. Wanneer “alleen” structuurbepaling door triangulatie is gewenst, kunnen een aantal eenvoudiger twee kleuren smFRET experimenten met hoge signaal-/ ruisverhouding uitgevoerde¹²^,¹⁹.

We gebruiken de gedeeltelijke fluorescentie () als een proxy voor de energie-overdracht tussen twee fluorophores⁷. De PF is berekend op basis van de fluorescentie intensiteit analoog aan de efficiëntie van de FRET van een experiment van twee kleuren:

Waar, is de intensiteit in emissie kanaal em na excitatie met kleur ex, en c is de acceptor met de langste golflengte. Detectie kanalen vertegenwoordigen dezelfde positie in de monsterkamer maar record verschillende spectrale reeksen van de fluorescentie-licht. Dezelfde id voor excitatie en emissie in dit protocol worden gebruikt (dat wil zeggen, “blauw”, “groene” en “rode”).

De gemeten fluorescentie-intensiteiten hangen vanwege experimentele tekortkomingen van niet alleen op de energie-overdracht, maar ook op fluorophore en setup-eigenschappen. Met het oog op het spuitrendement waar energie tussen twee fluorophores, de gemeten intensiteiten moeten worden gecorrigeerd. De volgende procedure is gebaseerd op referentie⁹. Correctiefactoren voor zichtbare lekkage (lk, dat wil zeggen, de detectie van fotonen van een fluorophore in een kanaal voor een andere kleurstof aangewezen) en schijnbare gamma (ag, dat wil zeggen, de fluorescentie quantumrendement van de kleurstof en de de efficiëntie van de detectie van het kanaal) single-molecuul sporen die aantonen dat een accepteerder bleken gebeurtenis worden verkregen.

De lekkage van de kleurstof van de donor in elk mogelijk acceptor kanaal is berekend op basis van alle gegevenspunten in de sporen van de opgenomen fluorescentie waar de acceptor kleurstof gebleekt maar de donor is nog steeds TL ():

De mediaan van de lekkage histogram wordt gebruikt als de schijnbare lekkage factor. Na correctie voor lekkage, wordt de schijnbare gamma factor bepaald door de dezelfde set van sporen. Het wordt berekend door de verandering van fluorescentie in de acceptor kanaal door de verandering van fluorescentie in het kanaal van de donor bij het bleken van de acceptor kleurstof:

Waarbij c staat weer voor de detectie-kanaal voor de acceptor met de langste golflengte. De mediaan van de resulterende verdeling wordt gebruikt als de schijnbare correctiefactor.

De gecorrigeerde intensiteiten in elk kanaal worden verkregen door:

De PF wordt dan berekend volgens:

Verschillende bevolkingsgroepen kunnen worden gescheiden in de multi-dimensionale ruimte overspannen door de PF-s. De positie en de breedte van elke staat wordt bepaald door het aanbrengen van de gegevens met multi-dimensionale Gaussian functies. Latere optimalisatie van één wereldwijde HMM gebaseerd op alle sporen van de PF biedt een kwantitatieve beschrijving van de waargenomen kinetiek. Zelfs kleine veranderingen van de tarieven zijn waarneembaar.

HMMs bieden een manier van afgeleid van een staatsmodel uit een collectie van luidruchtige tijd sporen. Het systeem wordt beschouwd als in één van een reeks van discrete, verborgen frames op een bepaald moment en de eigenlijke observatie (dat wil zeggen, de emissie) is een probabilistische functie van deze verborgen staat²⁰. In het geval van TIRFM smFRET gegevens, kan de emissie waarschijnlijkheden b_ik per staat ik worden gemodelleerd door continue Gaussian waarschijnlijkheid dichtheid functies. Bij regelmatig verdeelde discrete tijd punten, kunnen overgangen van de ene naar een andere staat optreden volgens de overgang waarschijnlijkheid dat tijd-invariant is en hangt alleen af van de huidige status. De overgang matrix A bevat deze overgang waarschijnlijkheden een_ij tussen alle verborgen frames. De verdeling van de begintoestand geeft de staatspecifieke waarschijnlijkheid voor het eerste punt van de tijd van een spoor van de tijd. Met behulp van een maximaal-kans aanpak, kunnen deze parameters worden geoptimaliseerd om het best beschrijven de gegevens met de vooruit-achteruit en Baum-Welch algoritmen²⁰^,²¹. Dit levert de maximale waarschijnlijkheid schatters (MLE). Ten slotte kan de volgorde van de staat die waarschijnlijk geproduceerd het traject van opmerkingen met de Viterbi algoritme worden afgeleid. In tegenstelling tot andere HMM analyses van smFRET gegevens²⁴^,²⁵^,²⁶ wij gebruiken niet de HMM als een louter “glad” van de gegevens, maar de kinetische staatsmodel uittreksel uit de gegevensset zonder de noodzaak voor het aanbrengen van de nadruktijd histogrammen²⁷. HMM analyse wordt gedaan met in-house scripts met Igor Pro. Tenuitvoerlegging van de gedragscode is gebaseerd op referentie²¹. Wij bieden een software kit en voorbeeldige gegevens op onze website om te volgen van de punten 5 en 6 van dit protocol (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Volledige software is beschikbaar op aanvraag.

Tijd van punten in het gegevens met PF < -1 of PF > 2 in elk kanaal detectie de minimale uitstoot kans voor alle Staten (10^-200) zijn toegewezen. Hiermee voorkomt u dat kunstmatige overgangen op deze gegevenspunten.

De parameters voor de emissie waarschijnlijkheid worden verkregen van de pasvorm van de 3D histogram van de PF met Gaussiaans functies zoals beschreven in stap 5.7. Deze parameters worden vast gehouden tijdens de optimalisatie van de HMM.

In de gepresenteerde benadering, zijn de begintoestand distributie vector en de transitie matrix wereldwijd gebruikt om te beschrijven het hele ensemble van sporen. Zij zijn bijgewerkt op basis van alle N -moleculen van de gegevensset volgens referentie²⁷.

Startparameters voor de distributie van de oorspronkelijke toestand worden bepaald uit 2D projecties van de PF -histogram (stap 5.3) en de waarschijnlijkheid van de overgang zijn ingesteld op 0.05 met uitzondering van de waarschijnlijkheid om te verblijven in dezelfde staat, die zodanig zijn gekozen dat is de kans op een bepaalde toestand laten genormaliseerd naar eenheid.

Een waarschijnlijkheid profiling methode wordt gebruikt om betrouwbaarheidsintervallen (CIs) voor alle overgang tarieven²¹^,²², die dienen als zinvolle schattingen voor hun onzekerheid. Voor de berekening van de grenzen van de CI voor een bepaald tempo, is de kans op overgang van belang op een andere waarde dan de MLE bevestigd. Dit levert de test model λ’. Een waarschijnlijkheid verhouding (LR) test van de kans op gezien de gegevensset 0 wordt uitgevoerd volgens:

De betrouwbaarheid van 95% gebonden voor de parameter wordt bereikt wanneer LR 3.841, de 95% kwantiel van een x^{2 overschrijdt}-verdeling met een mate van vrijheid²²^,²³.

De kracht van de methode is aangetoond door middel van de Hsp90. Deze overvloedige eiwit is gevonden in bacteriën en eukaryoten, en maakt deel uit van de cellulaire stress reactie²⁸. Het is een veelbelovende drug doelwit van kanker behandeling²⁹. Hsp90 is een homodimer met één nucleotide-bindende zak op het N-terminaal gebied van elke subeenheid³⁰. Het kunt overgangen tussen ten minste twee wereldwijd verschillende conformaties, één gesloten en één N-terminal open, V-vormige conformatie¹⁹^,³¹^,³²ondergaan. De dimeric aard vraag direct de van de wisselwerking tussen de twee nucleotide bandplaatsen in Hsp90.

In het volgende, bieden wij een stapsgewijze protocol voor de data-acquisitie en de analyse van een experiment van de drie kleuren smFRET op gist Hsp90 en nucleotide. De conformatieafhankelijke binding van fluorescently geëtiketteerde AMP-PNP (AMP-PNP *, een niet-hydrolyseerbare analoog van ATP) wordt geanalyseerd. De toepassing van de beschreven procedure toelaat de studie van de nucleotide-bindende en tegelijkertijd de conformationele veranderingen van Hsp90 en daardoor onthult de Allosterie tussen de twee nucleotide-bindende zakken van Hsp90.

Protocol

1. installatie en vereisten Voer de Multi-Color smFRET metingen op een prisma-type TIRFM. Een beschrijving van een twee-kleur setup zoals een JoVE publicatie wordt gegeven referentie12. Bouw een multi kleur TIRFM. Een algemene lay-out wordt toegelicht in 9. Gebruik, omschakelbaar, diode gepompte vaste toestand continu wave lasers, die het gebruik van mechanische luiken in de excitatie-paden overbodig. Dienst een asymmetrische, langwer…

Representative Results

Multi kleur smFRET metingen zorgen ervoor dat de directe correlatie tussen twee of meer afzonderlijke interactie sites. Dit maakt de techniek uniek zijn voor het onderzoeken van multi-component systemen, zoals eiwitcomplexen. We richten op de presentatie van een drie kleuren smFRET experiment hier, die als een illustratief voorbeeld fungeert. De algemene workflow van de methode is afgebeeld in Figuur 1</stro…

Discussion

We presenteren de experimentele procedure om gegevens van de drie kleuren smFRET voor een complexe eiwit stelsel en een stapsgewijze beschrijving van de analyse van deze metingen te verkrijgen. Deze aanpak biedt de unieke mogelijkheid om de correlatie tussen meerdere interactie sites of conformationele wijzigingen direct te beoordelen.

Om geschikte Multi-Color single-molecuul gegevens op eiwitten te verkrijgen is het belangrijk om te voeren reproduceerbare metingen op een laag geluidsniveau. D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt gefinancierd door de Duitse Research Foundation (INST 39/969-1) en de Europese Onderzoeksraad door de ERC subsidieovereenkomst n. 681891.

Materials

Setup
vibration-damped optical table	Newport, Irvine, CA, USA	RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1196625
laser control unit	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1234465	Scientific Remote
aspheric telescope lenses	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 473/10	cleanup filter excitation
CF ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 532/10	cleanup filter excitation
CF ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 594/10	cleanup filter excitation
CF ex4	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	FL635-10	cleanup filter excitation
DM ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ594RDC	dichroic mirror excitation
DM ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	570DCXR	dichroic mirror excitation
DM ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ491RDC	dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis	AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA		high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP	piezosystem jena GmbH, Jena, Germany		Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper	Newport, Irvine, CA, USA	PZA12	PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses	Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany	G322-304-000	d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit	Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany	27.160.1212	max. aperture 12 x 12 mm
DM det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	T 600 LPXR	dichroic mirror detection
DM det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	H 560 LPXR superflat	dichroic mirror detection
DM det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	HC BS R635	dichroic mirror detection
BP det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	525/40 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	586/20 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	631/36 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det4	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	700/75 ET Bandpass	bandpass filter detection
optical shutters detection	Vincent Associates, Rochester, NY, USA	Uniblitz VS25S2T0
EMCCD iXon Ultra 897	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535	National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	PHD22/2000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow chamber
quartz slides	G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA		Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	1626W	10 x 12cm
spray adhesive	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	Photo Mount 050777
glycerol	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany	Immersol G
immersion oil	OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany	IMMOIL-F30CC
prism	Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany		Suprasil1
aluminium prism holder			custom built
hollow setscrews	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	2-4450	ACF00001
PTFE tubing	Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany	S1810-08
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin			UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550	ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*	Jena Bioscience, Jena, Germany		γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	F8764	amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Andor Solis	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland		version 4.30
LabVIEW	National Instruments, Austin, Texas, USA		version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software	AA Opto-Electronic, Orsay, France		version 2.03a
Coherent Connection	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA		version 3
Igor Pro	WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA		version 6.37

References

Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90’s mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
Fink, G. A. . Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).
Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).