Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Markus G&#246;tz; Philipp Wortmann; Sonja Schmid; Thorsten Hugel

doi:10.3791/56896

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Published: January 30, 2018

doi:

10.3791/56896

Markus Götz, Philipp Wortmann, Sonja Schmid², Thorsten Hugel

¹Institute of Physical Chemistry,University of Freiburg, ²Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft,Delft University of Technology

Summary

Здесь мы представляем протокол для получения трехцветных smFRET данных и их анализ с 3D ансамбль скрытой марковской модели. С этим подходом ученые могут извлекать кинетическая информацию из сложных белковых систем, включая кооперативность или коррелированные взаимодействий.

Abstract

Одноместный молекула Фёрстер резонанс передачи энергии (smFRET) стала широко используемый биофизический метод для изучения динамики биомолекул. Для многих молекулярных машин в клетки белки должны действовать вместе с взаимодействия партнеров в функциональных цикла для выполнения их задачи. Расширение два цвета многоцветные smFRET позволяет одновременно исследовать более чем одной взаимодействия или конформационные изменения. Это не только добавляет новое измерение к smFRET эксперименты, но он также предлагает уникальную возможность непосредственно изучить последовательность событий и Обнаружение коррелированных взаимодействия при использовании иммобилизованных образца и полного внутреннего отражения флуоресценции Микроскоп (TIRFM). Таким образом многоцветные smFRET является универсальным инструментом для изучения биомолекулярных комплексов в количественном выражении и ранее недостижимое подробно.

Здесь мы продемонстрируем для преодоления особых проблем многоцветные smFRET экспериментов на белки. Мы представляем подробные протоколы для получения данных и извлечения кинетическая информации. Это включает в себя критерии отбора трассировки, разделение государства и восстановления государства траекторий от шумных данных с использованием 3D ансамбль скрытой марковской модели (HMM). По сравнению с другими методами, кинетическая информация не восстанавливается от гистограммы времени останавливаться, но непосредственно от Хм. Рамки максимального правдоподобия позволяет нам критически оценивать кинетическая модель и для обеспечения значимого неопределенности для ставок.

Применяя метод белка теплового шока 90 (Hsp90), мы в состоянии отделить нуклеотида привязки и глобальные конформационные изменения белка. Это позволяет нам непосредственно наблюдать кооперативность между двумя нуклеотидов привязки очагов Hsp90 димер.

Introduction

Многие белки выполняют свои функции в динамической комплексы с другими молекулами, посредничестве конформационные изменения и переходных ассоциаций по широкому спектру сроков¹^,²^,³. В сочетании с внешнего источника энергии (например, АТФ) эти динамические взаимодействия может привести к получателю в цикле функциональных и в конечном счете сохранить неравновесного установившемся в клетке, необходимым условием для жизни.

Для того чтобы полностью понять эти молекулярные машины, статическое описание, руководствуясь структурных исследований не является достаточным. Кроме того важно иметь знания о базовой кинетической модели и определить константы кинетической скорости. Несколько существующих методов позволяют исследователям изучить динамику бинарных взаимодействий между двумя молекулами интерес, например, поверхностного плазмон резонанс, методы релаксации с спектроскопических индикация (например, прыгать или остановить поток методы) и ядерного магнитного резонанса. Однако их применимости, в большинстве случаев, ограничивается простых систем двух государств (например, одна граница и одно государство, несвязанных) благодаря усреднение присущие массовых экспериментов. В тех случаях, когда речь идет о более государств или промежуточных продуктов они дают только сложная смесь константы скорости. Одноместный молекула методы, такие как магнитные или оптические пинцеты или два цвета smFRET, то есть, один из доноров и один акцепторной Флюорофор, с образец поверхности прикол может восстановить константы скорости для всех наблюдаемых конформационных изменений. Однако когда дело доходит до взаимодействия, затрагивающих более одной привязки сайта, эти методы по-прежнему ограничены, и информация о возможной корреляции двух (или более) взаимодействия только будут доступны через косвенные выводы из набора экспериментов.

Многоцветные smFRET⁴^,⁵^,⁶^,^,⁷⁸^,⁹ предлагает возможность изучить взаимодействие между этими компонентами непосредственно в режиме реального времени и под рядом физиологические условия¹⁰. Это позволяет исследовать например, конформация зависимых Связывание лиганда или другой белок⁸^,⁹^,¹¹. Общий подход, представленные здесь является маркировать белки интерес в определенных позициях, прикрепить один белка на поверхности измерительной камеры, а также отслеживать интенсивности флуоресценции со временем на призму типа TIRFM (для подробности см ⁹ ^, ¹²). пространственная близость различных красителей, затем может быть определено из передачи энергии между ними. Маркировка стратегии может варьироваться от белка белка (обзор в ¹³) и руководящие принципы, чтобы избежать артефактов в smFRET измерения существуют¹⁴.

Поскольку краска доноров может передавать энергию различных акцептора красителей в эксперименте многоцветные smFRET, относительное положение всех красителей не доступен от возбуждения одного красителя только¹⁵^,¹⁶. Но в сочетании с чередующимися лазерного возбуждения (Алекс¹⁷и рассмотренных в ¹⁸) Этот метод обеспечивает все пространственно временной информации на секунды и резолюции Подкомиссии нанометров.

В принципе высоким разрешением, которую структурная информация может быть достигнуто с помощью расстояния между краситель рассчитывается из комбинации всех интенсивностью флюоресценции в многоцветные smFRET эксперимент с АЛЕКСОМ. Однако здесь мы сосредоточиться на идентификации состояний и разделения, а также добыча кинетической модели, где smFRET многоцветные незаменим. Когда «только» для определения структуры путем триангуляции, набор проще-двухцветный smFRET экспериментов с высоким соотношением сигнал шум может быть осуществляется¹²^,¹⁹.

Мы используем частичное флюоресценция () как прокси для передачи энергии между двумя флуорофоров⁷. PF рассчитывается от интенсивности флуоресценции аналогична эффективности ладу-двухцветный эксперимента:

Где интенсивность выбросов канал ет после возбуждения с цветом ex, и c акцептор с длинной волны. Обнаружение каналов представляют собой ту же позицию в пример камеры, но записи различных спектральных диапазонах света флуоресцирования. Тот же идентификатор для возбуждения и выбросов используются в настоящем Протоколе (т.е., «синий», «зеленых» и «красных»).

Из-за экспериментальной недостатки интенсивностью флюоресценции измеренных зависит не только на передачу энергии, но и на Флюорофор и установки свойств. Чтобы получить истинное энергетической эффективности передачи между двумя флуорофоров, измеряемых интенсивностей должны быть исправлены. Следующая процедура основана на ссылку⁹. Поправочные коэффициенты для явного утечки (lk, т.е. обнаружение фотонов от Флюорофор в канале, предназначенные для другого красителя) и очевидной гамма (ag, т.е. квантовый выход флуоресценции красителя и эффективность обнаружения канала) получаются из одной молекулы следы, которые показывают акцептора отбеливания событие.

Утечки доноров красителя в каждый канал возможно акцептора рассчитывается от всех точек данных в записанных флуоресценции следы где краска акцептора отбеленная, но доноров до сих пор флуоресцентные ():

Медиана утечки гистограммы используется как фактор явно утечки. После коррекции для утечки очевидной гамма фактор определяется из того же набора трассировок. Она рассчитывается путем деления изменения флюоресценции в акцепторной канал изменения флюоресценции в канале доноров после отбеливания акцептора красителя:

Где c снова является каналом обнаружения акцептор с длинной волны. Медиана распределения результирующей используется как очевидной поправочный коэффициент.

Исправленные интенсивностей в каждом канале получаются путем:

PF рассчитывается согласно:

Различные группы населения могут быть разделены в многомерном пространстве, занимаемых PFs. Положение и ширину каждого государства определяется путем установки данных с многомерной функции Гаусса. Последующей оптимизации одной глобальной Хм, основанные на все следы PF обеспечивает количественное описание наблюдаемых кинетики. Даже небольшие изменения ставок обнаруживаются.

HMMs обеспечивают способ выведение модель государства из коллекции шумных следы. Система считается одним из набора дискретных, скрытые состояния в любой момент времени и фактические наблюдения (т.е. выбросов) является вероятностное функцией этой скрытой государственной²⁰. В случае TIRFM smFRET данных выбросов вероятностей b,_я за государство, я могут быть смоделированы путем непрерывного Гауссова плотность вероятности функций. В точках через равные интервалы времени дискретных переходы от одного до другого государства может произойти согласно переход вероятность того, что время инвариантная и зависит только от текущего состояния. Матрицы перехода A содержит эти вероятности перехода _ij между всеми скрытые государствами. Начальное состояние распространения дает вероятностей положени специфически для первой точки время время трассировки. Методом максимального правдоподобия, эти параметры могут быть оптимизированы, чтобы лучше всего описать данные с вперед-назад и Баум-Уэлч алгоритмов²⁰^,²¹. Это дает оценок максимального правдоподобия (MLE). Наконец государство последовательность, которая скорее производится траектории наблюдений может быть выведено с Витерби алгоритм. В отличие от других анализов Хм smFRET данных²⁴^,^,²⁵²⁶ мы не используем HMM как всего лишь «разглаживание» данных но экстракт кинетическая общегосударственной модели из набора данных без необходимости для установки времени задержки гистограммы²⁷. HMM анализ делается с собственных скриптов с использованием Игорь Pro. Реализация кода основана на ссылку²¹. Мы предлагаем комплект программного обеспечения и образцовые данные на нашем сайте для того, чтобы следовать разделы 5 и 6 настоящего Протокола (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Полное программное обеспечение предоставляется по запросу.

Времени точек данных с PF < -1 или PF > 2 в любой канал обнаружения назначаются минимальные выбросы вероятность для всех государств (10^-200). Это предотвращает искусственных переходы в этих точках данных.

Параметры для вероятностей выбросов получаются из fit 3D PF гистограммы с гауссова функций, как описано в шаге 5.7. Эти параметры хранятся фиксированной во время оптимизации Хм.

В представленный подход начальное состояние распределение вектора и матрицы перехода используются глобально описать весь ансамбль следов. Они обновляются на основе всех N молекул из набора данных по ссылке²⁷.

Параметры запуска для распространения начального состояния определяются из 2D прогнозы PF гистограммы (шаг 5.3) и вероятности перехода устанавливаются 0,05 за исключением вероятность остаться в том же состоянии, которые выбираются такие что вероятность оставить определенного состояния нормализуется к единству.

Метод профилирования вероятность используется дать доверительные интервалы (ди) для всех перехода ставки²¹^,²², которые служат в качестве значимых оценок их неопределенности. Для вычисления границы CI для конкретной скорости, вероятность перехода интерес фиксируется значение, отличное от ОМП. Это дает тест модель λ’. Соотношение (LR) тест вероятности вероятности набора данных 0 выполняется согласно:

95% доверия, предназначенной для параметра достигается, когда LR превышает 3.841, 95% квантиль о x²-распределение с одной степенью свободы²²^,²³.

Сила метода подтверждается с помощью Hsp90. Этот белок в изобилии встречается в бактерий и эукариот и является частью клеточного стресса ответ²⁸. Это перспективные цели наркотиков в рака лечение²⁹. Hsp90 является Антуану с один карман привязки нуклеотидов в N-концевой домен каждая субъединица³⁰. Он может подвергнуться переходы между по крайней мере двух глобально собственный конформации, закрывается и один N-терминала открытым, V-образный конформации¹⁹^,³¹^,³². Димерной природы непосредственно поднимает вопрос о взаимосвязи между двумя сайтами привязки нуклеотидов в Hsp90.

В следующем, мы предоставляем пошаговые протокол для сбора и анализа данных эксперимента трехцветной smFRET дрожжи Hsp90 и нуклеотидов. Конформации зависимые привязки дневно обозначенные AMP-PNP (AMP-PNP *, не гидролизуется аналоговый АТФ) анализируется. Приложение описанная процедура позволяет исследование нуклеотида привязки и в то же время конформационные изменения Hsp90 и таким образом раскрывает кооперативность между двумя нуклеотидов привязки очагов Hsp90.

Protocol

1. Установка и предпосылки Выполните измерения многоцветные smFRET Призма типа TIRFM. Описание установки двух цветные как Зевс публикации дается ссылка12. Постройте TIRFM многоцветные. Генеральный план подробно в 9. Использование переключаемый, диодной …

Representative Results

Многоцветные smFRET измерения позволяют прямое обнаружение корреляции между двумя или более сайтами различных взаимодействия. Это делает технику уникальный расследовать многокомпонентных систем, таких как белковых комплексов. Мы сосредоточены на презентации трехцве?…

Discussion

Мы представляем экспериментальная процедура получения трехцветных smFRET данных для сложных белков системы и пошаговое описание анализа этих измерений. Этот подход предоставляет уникальную возможность непосредственно оценить взаимосвязь между несколькими взаимодействия сайтов или к…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансируется немецкого фонда научных исследований (INST 39/969-1) и Европейский исследовательский совет через соглашение грантов ЕИС n. 681891.

Materials

Setup
vibration-damped optical table	Newport, Irvine, CA, USA	RS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASER	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1196625
laser control unit	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA	1234465	Scientific Remote
aspheric telescope lenses	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		d=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 473/10	cleanup filter excitation
CF ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 532/10	cleanup filter excitation
CF ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZET 594/10	cleanup filter excitation
CF ex4	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	FL635-10	cleanup filter excitation
DM ex1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ594RDC	dichroic mirror excitation
DM ex2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	570DCXR	dichroic mirror excitation
DM ex3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	ZQ491RDC	dichroic mirror excitation
AOTFnC-Vis	AA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plate	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA	AQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100x	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA		high-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAP	piezosystem jena GmbH, Jena, Germany		Piezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepper	Newport, Irvine, CA, USA	PZA12	PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lenses	Qioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, Germany	G322-304-000	d=50mm, f=200mm
adjustable optical slit	Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany	27.160.1212	max. aperture 12 x 12 mm
DM det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	T 600 LPXR	dichroic mirror detection
DM det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	H 560 LPXR superflat	dichroic mirror detection
DM det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	HC BS R635	dichroic mirror detection
BP det1	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	525/40 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det2	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	586/20 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det3	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	631/36 BrightLine HC	bandpass filter detection
BP det4	AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany	700/75 ET Bandpass	bandpass filter detection
optical shutters detection	Vincent Associates, Rochester, NY, USA	Uniblitz VS25S2T0
EMCCD iXon Ultra 897	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535	National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	PHD22/2000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow chamber
quartz slides	G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA		Spectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	1626W	10 x 12cm
spray adhesive	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	Photo Mount 050777
glycerol	Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany	Immersol G
immersion oil	OLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, Germany	IMMOIL-F30CC
prism	Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany		Suprasil1
aluminium prism holder			custom built
hollow setscrews	Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA		with custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubing	neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	2-4450	ACF00001
PTFE tubing	Bohlender GmbH, Grünsfeld, Germany	S1810-08
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin			UniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550	ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*	Jena Bioscience, Jena, Germany		γ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
Fluospheres	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	F8764	amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Andor Solis	Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland		version 4.30
LabVIEW	National Instruments, Austin, Texas, USA		version 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control software	AA Opto-Electronic, Orsay, France		version 2.03a
Coherent Connection	Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA		version 3
Igor Pro	WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA		version 6.37

References

Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 22 (14), 3486-3492 (2003).
Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
Hohng, S., Joo, C., Ha, T. Single-Molecule Three-Color FRET. Biophys J. 87 (2), 1328-1337 (2004).
Person, B., Stein, I. H., Steinhauer, C., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. Correlated movement and bending of nucleic acid structures visualized by multicolor single-molecule spectroscopy. ChemPhysChem. 10 (9-10), 1455-1460 (2009).
Lee, J., Lee, S., Ragunathan, K., Joo, C., Ha, T., Hohng, S. Single-molecule four-color FRET. Angew Chem Int Ed. 49 (51), 9922-9925 (2010).
Ratzke, C., Berkemeier, F., Hugel, T. Heat shock protein 90’s mechanochemical cycle is dominated by thermal fluctuations. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 161-166 (2012).
Ratzke, C., Hellenkamp, B., Hugel, T. Four-colour FRET reveals directionality in the Hsp90 multicomponent machinery. Nat Commun. 5, 4192 (2014).
Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. A Multicolor Single-Molecule FRET Approach to Study Protein Dynamics and Interactions Simultaneously. Methods Enzymol. 581, 487-516 (2016).
Yengo, C. M., Berger, C. L. Fluorescence anisotropy and resonance energy transfer: Powerful tools for measuring real time protein dynamics in a physiological environment. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 731-737 (2010).
Wortmann,P , ., Götz M, ., Hugel T , . Cooperative Nucleotide Binding in Hsp90 and Its Regulation by Aha1. Biophys J. 113, 1711-1718 (2017).
Dörfler, T., Eilert, T., Röcker, C., Nagy, J., Michaelis, J. Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System. J Vis Exp. (120), e54782 (2017).
Stephanopoulos, N., Francis, M. B. Choosing an effective protein bioconjugation strategy. Nature chemical biology. 7 (12), 876-884 (2011).
Sánchez-Rico, C., Voith von Voithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. Effects of Fluorophore Attachment on Protein Conformation and Dynamics Studied by spFRET and NMR Spectroscopy. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). , (2017).
Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
Lee, N. K., et al. Three-color alternating-laser excitation of single molecules: monitoring multiple interactions and distances. Biophys J. 92 (1), 303-312 (2007).
Kapanidis, A. N., Lee, N. K., Laurence, T. A., Doose, S., Margeat, E., Weiss, S. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (24), 8936-8941 (2004).
Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. 14, 174-180 (2017).
Rabiner, L. R. A tutorial on hidden Markov models and selected applications in speech recognition. Proc IEEE. 77 (2), 257-286 (1989).
Fink, G. A. . Markov Models for Pattern Recognition. , (2014).
Giudici, P., Ryden, T., Vandekerkhove, P. Likelihood-Ratio Tests for Hidden Markov Models. Biometrics. 56 (3), 742-747 (2000).
Visser, I., Raijmakers, M. E. J., Molenaar, P. C. M. Confidence intervals for hidden Markov model parameters. Br J Math Stat Psychol. 53 (2), 317-327 (2000).
McKinney, S. A., Joo, C., Ha, T. Analysis of Single-Molecule FRET Trajectories Using Hidden Markov Modeling. Biophys J. 91 (5), 1941-1951 (2006).
Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning Rates and States from Biophysical Time Series: A Bayesian Approach to Model Selection and Single-Molecule FRET Data. Biophys J. 97 (12), 3196-3205 (2009).
Greenfeld, M., Pavlichin, D. S., Mabuchi, H., Herschlag, D. Single Molecule Analysis Research Tool (SMART): an integrated approach for analyzing single molecule data. PLoS ONE. 7 (2), e30024 (2012).
Schmid, S., Götz, M., Hugel, T. Single-Molecule Analysis beyond Dwell Times: Demonstration and Assessment in and out of Equilibrium. Biophys J. 111 (7), 1375-1384 (2016).
Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (7), 515-528 (2010).
Trepel, J., Mollapour, M., Giaccone, G., Neckers, L. Targeting the dynamic HSP90 complex in cancer. Nat Rev Cancer. 10 (8), 537-549 (2010).
Wayne, N., Bolon, D. N. Dimerization of Hsp90 is required for in vivo function. Design and analysis of monomers and dimers. J Biol Chem. 282 (48), 35386-35395 (2007).
Ali, M. M. U., et al. Crystal structure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex. Nature. 440 (7087), 1013-1017 (2006).
Southworth, D. R., Agard, D. A. Species-dependent ensembles of conserved conformational states define the Hsp90 chaperone ATPase cycle. Mol Cell. 32 (5), 631-640 (2008).
Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12893-12898 (2004).
Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophys J. 94 (5), 1826-1835 (2008).
Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
Rognoni, L., Stigler, J., Pelz, B., Ylänne, J., Rief, M. Dynamic force sensing of filamin revealed in single-molecule experiments. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19679-19684 (2012).
Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic. Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).
Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17 (16), 4829-4836 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Götz, M., Wortmann, P., Schmid, S., Hugel, T. Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions. J. Vis. Exp. (131), e56896, doi:10.3791/56896 (2018).