動的なを促進するために齧歯動物のミクログリアの分離と培養分岐無血清培地の形態

Summary

ミクログリアの機能の詳細を理解するための努力は、生体内で成熟したミクログリアの特性を要約ミクログリア培養モデルの欠如によって妨げられています。このプロトコルは定義されている培地条件下で高度分岐し成熟ラット ミクログリアの堅牢な生存を維持するために設計された分離と培養手法を指します。

Abstract

ミクログリアは、中枢神経系 (CNS) のすべてのセルの 5-10% を表し、開発、恒常性と病の間に彼らの貢献のための注目に高まっています。マクロファージは、数十年、ミクログリアの特殊な機能、中枢神経系の組織に常駐マクロファージの詳細研究されてきたが大きく神秘的な成熟したミクログリアを要約する能力の制限により一部に残っています。文化のプロパティ。ここでは、私たちは成熟した齧歯動物の脳から純粋なミクログリアの急速な隔離のための簡単な手順を示しています。時間をかけてミクログリア生存率の高レベルをサポートする無血清培養条件についても述べる。これら定義培地条件下で培養したミクログリア精巧な区分されたプロセスと動的監視行動を表わします。我々 は議論するどのミクログリアの生体内と同様、両方の文化の血清露出に比較してこれらの無血清培養および培養マイクログリアに及ぼす血清露出を示しています。

Introduction

中枢神経系の柔組織のマクロファージ、ミクログリア神経回路とグリア細胞のシグナリング ネットワークの広大な配列と通信します。彼らは開発およびシナプスの刈り込み、アポトーシス細胞のクリアランスと神経突起^1,2で一時的な相互作用を介して脳の恒常性の重要な役割を果たします。ミクログリアは、病変部に炎症性応答を調整し出血の^3、4を制限する彼らの長い、細いプロセスを拡張する神経学的な傷害に初期応答です。ミクログリアの形態と機能の変化は、急性および慢性の両方の中枢神経系傷害、ユビキタス、ミクログリア展示変更形態、ローカリゼーション、および多様な疾患状態¹中の炎症メディエーターの発現。人間の遺伝学的研究を示す神経変性疾患のための危険を変える突然変異は、病気の発症や進行^{5 におけるミクログリアの重要な役割を指して、そのまま中枢神経系におけるミクログリアによって表現頻繁に主にまたは専らこと}.けがや病気の彼らの卓越性を与えられた、新しい治療上のアプローチを開発するための高い優先度は、ミクログリアの生物学の理解を促進します。

ミクログリアの生物学の理解には多くの重要な進歩はテクニックとメカニズム他マクロファージを培養、遺伝子発現プロファイル、および機能の定義を含む集団の研究で発見された推定することによって生じています。形態/状態。マクロファージ機能しばしば中枢神経系ランドス ケープ内で意外な方法で再生を一般化、ミクログリアは自分自身、専門性の高い、分岐された形態および他の組織から離れてそれらを設定するユニークな遺伝子発現シグネチャを出展マクロファージ⁶。ミクログリアは他のほとんどのティッシュの大食細胞の異なる系統があります。彼らは原始造血の初期胚性波の中に中枢神経系を植民地化し、自己決定的な造血⁷からの貢献の独立した、生涯更新します。大人マイクログリアの完全に成熟した遺伝子発現シグネチャは、第 2 の⁸の生後週まで達成されていません。周囲の組織から環境の手がかりは、組織固有のマクロファージ機能⁶、中枢神経系血液脳関門⁹によって与えられた血液媒介要因への限られた露出を含むを口述筆記で主要な役割を果たします。

完全にミクログリアへの中枢神経の恒常性や病気を理解するための 1 つの障害が見られる成熟したミクログリア体内浄化された細胞の特殊なプロパティをさたの難しさ体外。分離する多くの方法が開発されている、文化そのままミクログリアがほとんどアプローチ細胞生存率をサポートするための血清に依存します。生理活性分子の広大な配列を含む本質的に変数の試薬は、ミクログリアの操作それはアメーバの形態を促進するため増加増殖は、特に問題となる、血清を加えている示されていると貪食亢進⁹は、ミクログリアが血液血液-脳関門の破壊後の要素にさらされる生体内でよく見かけます。これらのメトリックによって血清曝露細胞は、けがや病気の状態、ミクログリアを似ていますが、このような変化を減少しているミクログリアを亜セレン酸、コレステロール、TGF-β 髄液 1 (または IL-34) を含む定義された成長培地で培養すると。

このプロトコルは、最近出版された仕事⁹に関連する無血清条件下で幼若ラット ミクログリアを培養するための詳細を提供します。このプロトコルは、ラット生後 21-30 (P21 - P30) より合理化されていますが、収量および全体的な生存率は種および動物の年齢によって異なりますがラットおよびあらゆる年齢のマウスのミクログリアの分離に適応することができます。最大利回りし、若干未熟なミクログリアを使用するときに最適な生存を達成 (~ P9)、利回りと徐々 に先を細くやや大人動物の下位レベルの生存率。ミクログリアはマウスから分離することができますが、我々 はラットの細胞を示す有意に高い利回り、実行可能性、および分岐された形態の複雑さ無血清培養マウス細胞と比較して発見しました。動物が P50 より大きい高齢者このプロトコルで評価されていません。この immunopanning の分離のプロシージャは分離中ミクログリア転写プロファイルの変化を最小限にしてセルの下流の可能性を最大化する最適化されています。これらの技術とメディアの製剤を使用して、週間高生存率初代培養を維持できます。これらの条件下で培養したミクログリアは急速な拡張とプロセスの撤回を含む高度分岐し形態を展示し、増殖率が比較的低い。これらのプロパティの血清露出の意義を強調し、他のアプローチと比較してこの方法の長所と短所を話し合います。

Protocol

齧歯動物を含むすべてのプロシージャは、国立と州法およびポリシーに準拠したスタンフォード大学のガイドラインに適合。動物のすべてのプロシージャは、スタンフォード大学の研究所動物愛護管理パネルによって承認されました。

注: すべてのソリューションとバッファー組成材料のテーブルで提供されます。

1. 準備ペトリ皿 CD11b Immunopanning (0 日)

注: は、すべての 1-2 の幼若ラット脳の 1 immunopanning 料理を準備します。

1. 15 cm のシャーレに 50 mm Tris pH 9.5 液 25 mL を追加します。
2. 6 μ G/ml の最終的な集中のための料理にヤギ抗マウス IgG (H + L 鎖) を追加します。均等に板を旋回します。
3. 37 ° C で 1-3 h の皿を孵化させなさい
4. DPBS +⁺ (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca^{2 +}と Mg^{2 +}) と 3 回リンス料理パン 1 μ G/ml OX42 抗体を含むバッファーのソリューションに置き換えます。平らな面に室温で一晩料理を残します。

2. 組織コレクション (1 日目)

注: このプロトコルは、3 〜 4 時間を取る必要があります。

1. 始める前に、すべてのソリューションは、滅菌、冷たい氷の上を確認します。氷の上のすべての機器を冷やすし、使用前にエタノールで消毒します。
2. 次の適切な規制制定手続、二酸化炭素の窒息によって少年の実験用ラットを犠牲に。
   注: また、若い動物が犠牲になるケタミン ・ キシラジン (24 mg/mL ケタミン、2.4 mg/mL キシラジンの 100-200 μ L) の致命的な線量を持つ。動物は年齢の 14 日以内である場合、ケタミン ・ キシラジンを使用する必要があります。複数の動物を使用している場合 1 つの動物から組織を抽出し、その後動物に進む前に氷の上あらかじめ冷やした DPBS^{+ +}に配置。
3. 続行する前に動物から完全な応答がないを確保して、後足をピンチします。
4. Transcardially は、10-30 mL の冷たい血流バッファー バッファー クリアを実行するまでに 27 G の針を使用して動物を灌流します。
   注: 灌流バッファーの量は、動物のサイズ/年齢によって異なります。
5. 灌流後すぐに動物の頭を削除します。両側後頭顆を解剖ハサミで切って脊髄から来て、脳を損傷しないように注意します。慎重にそれぞれの側を切り、頭頂に向かって鼻の骨の前面の骨に沿って片側をカットします。鉗子で慎重に頭蓋骨の上部を引いて、すぐに取り外し脳 (または興味の中枢神経系の構造)、中古冷蔵 DPBS^{+ +}に氷の上。
6. 残りのすべての動物に対して繰り返します。
   注: 適切な無菌条件の下で層流フードの手続のすべての手順を実行必要があります。

3. 機械的解離 (1 日目)

1. すべての脳が収集された後冷たいメス刃で氷の上のシャーレに 1 mm³チャンクに一つの脳をチョップし、5-7 mL 冷たい douncing バッファーと冷たい dounce ホモジナイザー転送します。一度に 1 つの脳を切り離します。
2. ゆったりした dounce ホモジナイザーを用いた 10-20 穏やかで不完全なストロークを使用して組織を切り離して考えます。直接粉砕、ホモジナイザーの下部組織ではなく、代わりにピストンの側面と、ホモジナイザー間の空間を通じて組織をインペル世話をします。
3. 気泡の導入を防ぐためにピストンを慎重に取り外します。ホモジナイザーの底に沈殿する不十分な解離組織塊を許可し、上清を新しい冷蔵 50 mL コニカル チューブに転送します。
4. 新鮮な douncing のバッファー、削除されたボリュームに置き換え、3-4 ラウンド、またはすべての組織が関連付けが解除されるまで合計 3.2 と 3.3 の手順を繰り返します。それぞれの脳の手順を繰り返します。

4. ミエリン除去 (1 日目)

注: ミエリン除去は、ミクログリア P12 より古い動物からの分離に使用されます。

1. 25 mL のピペットを使用して 50 mL コニカル チューブに細胞懸濁液の体積を測定し、33.5 mL に容量を調整する冷たい douncing バッファーを追加します。
2. 数回チューブの反転によって徹底的に細胞懸濁液とミックスに 10 mL の髄分離バッファー (MSB) を追加します。これは 43.5 mL の容積の MSB の 23% の最終濃度になります。
3. ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分の細胞を遠心します。
   注: 遠心分離機は、減速する約 1.5-2 分を取る必要があります。これはミエリンと死んだ細胞の残骸、やや濁った上澄み、生きた細胞の濃縮は小さいペレットの上位層が生成されます。
4. ミエリン/破片やピペットで上澄みの最上位のレイヤーを削除します。それの多くは可能な限り削除されますを確保するための最上位のレイヤーを削除するとき注意してください。
5. バッファーをパンの 12 mL の細胞ペレットを再懸濁します。残っているかもしれない細胞の任意の塊を破るに細胞懸濁液をそっとカップ刻んだ。

5. Immunopanning (1 日目)

1. 細胞懸濁液の大きい残骸または細胞塊を削除する 70 μ m セル ストレーナーに通過します。
2. 3 回 DPBS^{+ +}と OX42 コーティングのパン皿をすすいでください。プレートを許可しない洗浄の間完全に乾燥。
3. 最後の DPBS^{+ +}洗浄を離れて注ぎ、フィルター処理された細胞懸濁液をパン皿に適用します。優しく細胞を配布するプレートを旋回し、付着する細胞を許可する 20 分間室温で平らな面にプレートを孵化させなさい。20 分以上インキュベートはないまたは細胞がお皿から復旧が非常に困難になります。
4. 非付着性のセルを削除する DPBS^{+ +}とパン皿 10 倍をすすいでください。ミクログリアとなりますので他の非付着性のセルの除去を確保するため各リンス版は渦巻きプレートにしっかりと取り付け。
5. 最後の DPBS^{+ +}洗浄を離れて注ぎ、15 mL DPBS^{+ +}と 200 μ L トリプシン (1.25% 原液) で置き換えます。
6. 10% CO₂ trypsinize 37 ° C で ≤10 分の皿を孵化させなさい。
   注: が 10 分以上続行しないでくださいまたはミクログリアは除去が困難になります。
7. Trypsinization の 10 分後に、ミクログリアがプレートにまだ立ち往生しているが。トリプシン/DPBS^{+ +}を注ぎ、水洗いしてトリプシンを削除、冷たいミクログリア培 (MGM) 12 mL に置き換えます DPBS^{+ +}で 2 倍。
8. セル/基板相互作用を弱めるし、料理を確認できる場所を 2 分間氷の上の皿をパンはパン皿の分野の乾燥を防ぐためにフラットです。
9. 積極的のピペット 10 mL ピペット、ピペット コント ローラーと高速パン皿から細胞を回復します。すべてのセルを削除しようとするピペットから液の流れに 16 × 16 のグリッドを描画します。
10. 細胞をプレートからデタッチを確認する 20 倍の倍率の顕微鏡下の細胞をチェックしてください。細胞がまだ立ち往生している皿の上にスポットをマークとこれらの分野でピペッティング繰り返し。
11. 細胞懸濁液上清 15 mL の円錐管あたりの分注 3-4 mL を収集します。ゆっくりブレーキを 4 ° C で 500 × g で 15 分間スピンします。
    注: セルの最大復旧できます少量によるミクログリアを回転します。
12. 細胞ペレットに MGM の 0.5 mL を残して上清を吸引します。
13. 残りの MGM でペレットを再懸濁し、すべての管から細胞のプールします。
14. 検定でのセルをカウントします。
15. 手順 6 - アプリケーションに応じて 7 で説明したように細胞をプレート。
16. 10% の CO₂と 37 ° C で培養細胞。
    注: 正規メディア変更で最大 3-4 週間またはメディア変更なしで 1 週間の文化は、細胞がすることができます。

6. スポット コーティング組織培養プレート/Coverslips (1 日目)

1. 24 ウェル アニオン ・ カチオン コート培養皿の中央に直接コラーゲン IV コーティングの 15 μ L をプレート (詳細については材料の表を参照) と 10% の CO₂と 37 ° C で 15 分間インキュベートします。
2. 検定とセル数を計数後 MGM の 10⁵/mL × 2.3 に細胞を希釈します。コラーゲン IV スポット、すぐにこの場所; に細胞懸濁液の板 15 μ L を吸引します。これは 10 の³セル/スポット x 3.5 を与えます。井戸の中に優しく付着、500 μ L の CO_{2 -}平衡 TGF-β 2/IL-34/コレステロール含んでいる成長媒体 (TIC) を追加するセルを許可する 10% CO₂と 37 ° C で 5-10 分間インキュベートします。
3. めっき 10 μ G/ml の策略-D-リジン (PDL) H₂O の場合は常温では、1 h での最初のコート滅菌ガラス coverslips coverslips 場合 H₂O、3 回を洗浄し、紫外線の下でフードに乾燥させます。Coverslips 乾燥されたら、続行、coverslips スポットめっきステップ 6.2 で説明するよう。

7. RNA ・ タンパク質分離用めっき

1. 日 1、コート全域、24 ウェル アニオン ・ カチオンのコラーゲン IV コーティングと組織培養プレートのコーティングし 10% CO₂、37 ° C で 10 分-1 時間のためのインキュベートを削除し、すぐにプレートの 3 ~ 5 倍の CO₂の 10 の⁴細胞/ウェル平衡TIC メディア。
2. 2 日目、それぞれの準備の翌日も 50% メディアの変更を実行します。死んだ細胞で、井戸の中心クラスター、だからそこからメディアを取りがちであります。
3. 文化を維持するために 50% メディア変更ごとに 2-3 日間を実行します。メディアの変更は、文化の不要な変数を導入、細胞は定期的なメンテナンスで 3 週間以上のではなく、メディア変更せず約 1 週間生き残ることができます。

Representative Results

このプロトコルは、幼若ラットから文化分岐高純度ミクログリアにメソッドを説明します。同様の結果は、後述するように未熟な周産期および大人の動物を使用して取得できます。細胞分離には微妙なニュアンスや細胞を死の多くの機会があります、ので、さまざまな段階での成功を決定するため品質管理のチェックポイントを使いました。我々 は通常の隔離のプロトコル (図 1 a) 複数のステップで、検定を用いた細胞懸濁液を監視しました。成功した分離は、2.5-5 10⁵セル/少年動物 x を得られるはず。P7 - P15 から動物は、P30 より古い動物から分離した細胞を示す動物⁵セル/10 x 2.5 に近い利回りに対し 5 10⁵セル/動物、x に近い利回りを表示します。合計セルを監視を超えて、プロトコル全体カウントそれは難しいことができますこの方法で分離したミクログリア文化の最初の数日中に丸みを帯びたまたはバイポーラの形態を持っているので隔離されたセルの全体的な稼働状態を確認することが重要.ここでは、10% 牛胎児血清 (FCS) (図 1 b) を含む TIC TIC で分離後最初の 6 日間 P25 ミクログリアの位相画像文化に含めています。

図 1: 隔離のプロトコルの中に、文化の 6 日間で細胞の健康の評価します。(A) 位相差画像のセルの隔離プロシージャの指定された手順で示す品質管理チェックポイント。0.4% トリパン診断にロードする前に青の 1 μ L で細胞の懸濁液の 9 μ L を混合することによって細胞懸濁液をイメージしました。他の画像表示自体は、パン皿、すべての画像は、20 倍の倍率で 1 つのフィールドとして表示されます。スケール バー、200 μ m. MGM、ミクログリア成長媒体。(B) 時間ミクログリアの形態学的変化と増殖無血清チック成長媒体または TIC プラス 10% 牛胎児血清 (FCS) の文化 6 日間のコースです。CD11b immunopanned 細胞は、コラーゲン被覆アニオン ・ カチオン コート培養プレートにメッキのスポットでした (詳細については材料の表を参照)、位相コントラスト 100 μ m. TIC、TGF-β 2/IL-34 バーすべての 24 時間スケールによってイメージを作成した同じフィールドと/コレステロール含んでいる成長媒体。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

健康の定期的な評価と分離細胞の再現性と実験の成功にとって重要です。P21 動物 MGM、チック、または TIC 後 7 日間の in vitro (DIV) 実行可能性の試金と 10% の FCS を添加した培養から分離されたミクログリアを示します。文化ショー チック 7 部細胞血清の存在下で最終的にはしかし、これは両方の急速な拡散を人為的に水増しはこの措置によって生存率 100% の近くに登る後で 80-90% の生存率との間の分離が成功した場合血清曝露細胞とこれらの文化 (図 2 a) の中で死んだ細胞の急速な貪食。堅牢な生存に加えてチック培養細胞は、FCS と比較した場合、区分された形態の治療細胞 (図 2 b, C) をも表示します。

図 2: MGM、TIC または TIC + FCS ミクログリアの生存文化で 7 日間です。(A) セル P21 ラットから分離され、ミクログリア培 (MGM)、TGF-β 2/IL-34/コレステロール含んでいる成長媒体 (TIC)、または TIC + 10% ウシ胎仔血清 (FCS) で培養します。各時点で培はカルセイン AM (最終的な 1.33 μ M) とエチジウム ホモ (2.5 μ M 最終) 生きている細胞と死んだ細胞をそれぞれラベルを 15 分間で補われました。セルは、ImageJ を自動化するスクリプトを使用して各フィールドで数えられました。(BとC) 7 部後、メディア変更なしで細胞に成長した TIC (B) や 10 %fcs (C) を添加した TIC いた上記ライブと死んだ細胞をラベルするステンド グラスします。代表的な画像は、10 X (左) または 40 X (右) 目的を使用して撮影されました。スケール バー、40 μ m の誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。この図は、ボーレンらから変更されました。⁹とアクセス許可を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

高純度ミクログリアの分離を成功させる文化を示すためには、P21 のラットからミクログリアを分離しをチックまたは 8 日間の 10% の FCS と補われる TIC でこれらの細胞を培養しました。セル、固定されミクログリア マーカー (Iba 1 と CD11b) と増殖マーカー (キ67、図 3 a) のステンド グラスします。セル マーカーの染色のほか、新鮮単離細胞の RNA シーケンスは細胞の RNA プロファイルを評価するための強力で重要なツールを提供できるし、文化の開始の純度を知らせることができます。CD11b の小さな割合の結果通常 CD11b immunopanning⁺ CD11b に加えて好中球・単球持ち越し⁺ミクログリア (図 3 b)。これらの細胞は数日後チックで死んでしまうが、以前の時間ポイントの解析を複雑にすることができます。

図 3: 免疫組織および RNA シーケンスによって評価として培養細胞の純度(A) ミクログリアが P21 ラット、PDL/コラーゲンをコーティングしたガラス カバーガラス上メッキし、TGF-β 2/IL-34/コレステロール含んでいる成長媒体 (TIC) で 8 日間培養から分離されました。セルが 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 室温で 10 分間で固定し、Iba-1 (1: 500)、CD11b で免疫染色 (1:1500) とキ67 (1: 500)。簡単に言えば、固定セルを 0.1% 洗剤でブロックされた (詳細については方法表参照) と 10% 通常ロバ血清 (NGS) 室温で 1 時間。セルは、NGS 一晩 4 ° C で 1% と 0.1% 洗剤で一次抗体を添加して、セルは、PBS で各 5 分を 3 回洗浄しました。セル次いで, 二次抗体 1% と 0.1% 洗剤ですべて 1: 500 NGS 室温で 1 時間。細胞は再び 3 回を PBS で洗浄, DAPI を含むメディアをマウントをマウント.代表的な画像は、40 倍の倍率で撮影されました。スケール バー、50 μ m。 (B) 単離と培養細胞による代表的な細胞タイプ特定のコピーの表現。その他主要な中枢神経系細胞タイプ (アストロ サイト、ニューロン、オリゴデンドロ サイト、および血管内皮細胞) の RNA シーケンス マーカー表示の最小の汚染とミクログリアが P21 ラットから分離・ RNA の隔離のための immunopanning 料理から直接分離CD11b immunopanned 細胞。好中球マーカーは単離細胞 (黒) が検出されたが、無血清培養 (グレー) で失われています。培養細胞は、共通の大食細胞マーカーの高レベルを表現が専門ミクログリアのシグネチャの定義のマーカー迅速培養細胞ダウンレギュ レートです。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。データはボーレンらから変更されました。⁹とアクセス許可を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

生存率および細胞マーカーの染色、細胞の純度と存続決定のできますが、文化の動態に関する限定的な情報を提供します。ここでチックで 14 DIV 後 P21 ラットマイクログリアのコマ撮りムービーを提供しております。2 週間後、無血清培養プロセスの迅速な拡張とエディタジェームズ皿全体の動的監視動作を表示 (映画 1を参照)。さらに、我々 以前発見した血清露出がこれらの休憩、ミクログリアの状態の性質を変換形態と貪食能の変化を永続的に生じる。まずチックで 5 日間培養マイクログリアの映画を含まれているし、10% の FCS にさらされる (映画 2参照)。

映画 1: 定義された媒体ミクログリア文化表示区分された形態の動的過程と。ミクログリアは P21 ラット、スポット コラーゲン被覆アニオン ・ カチオン コート培養プレートにメッキし、TIC で 14 日間培養から分離されました。14 DIV で画像は 3 分毎に収集されました。6 フレーム/秒で再生し、右下のタイムスタンプを示す画像の期間ボーレンらから h:min. で映画を再現⁹とアクセス許可を使用します。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)

映画 2: 血清露出トリガー定義媒体ミクログリア文化の急速な形態変化。ミクログリアは P21 ラット、スポット コラーゲン被覆アニオン ・ カチオン コート培養プレートにメッキし、TIC で 5 日間培養から分離されました。5 DIV で画像は 5 分ごとに記録された運動と形態を 2:55 (2 時間 55 分) でのベースラインが収集された、最終濃度 10% の FCS を追加する 50% のメディアの変更を行った。さらに 7 時間細胞をイメージしました。6 フレーム/秒で再生、右下のタイムスタンプはこのビデオを表示するのにしてくださいここをクリックして h:min.で画像の期間を表します。(右クリックしてダウンロード)

Discussion

ミクログリアは、sentinel 中枢神経系の免疫担当細胞として機能するため、環境の変化に非常に敏感したがって、分離、文化⁸時に細胞内での炎症反応を最小限に抑えるため細心の注意が必要です。これは、速度と温度をこのプロトコルで実現されます。動物は冷たい血流バッファーと灌流し、組織の間の時間を最小限に抑えるために合理化されましたプロトコルまたは 4 ° C で氷の上のセルを維持可能な大幅活性化、ので 4 ° C で遠心分離のすべての手順を実行するたびに、抽出、細胞培養します。単離細胞の遺伝子発現パターンを評価し場合、は、分離による変化を最小限にとどめるための trypsinization 前 CD11b immunopanning 皿から直接のセル lysates を収穫します。注意すべきことも慎重に分離されたミクログリアおそらく本質的に分離のプロシージャに関連付けられている被害関連シグナルの認識のための暖かい温度に置かれている時にすぐに炎症性応答を実行します。プロトコルが正常に実行された場合は、2.5-5 10⁵セル/幼若ラット x が期待されています。

細胞の隔離のプロトコルに記載の CD11b + 灌流 CNS⁹から細胞を分離することに非常に特有です。この細胞集団は、ミクログリアの主にから成り、血管周囲マクロファージ、髄膜の大食細胞、脈絡叢マクロファージ、単球、好中球¹⁰などその他の骨髄性の人口の低レベルを含まれています。脈絡膜関連骨髄性細胞を認識し組織解離前脈絡叢の除去によって本質的に回避できます。髄膜は、ある程度、削除することも、すべての硬膜組織の完全な除去は、ここで説明の迅速単離のために目標の期限内実用的ではありません。したがって、髄膜の不完全な除去の変動を制限する私たちを取り外さないで髄膜。循環分離材料の単球・好中球の数を最小限に抑えるためにもきれいな血流に重要です、私たちは通常は灌流が不十分な組織を破棄します。優秀な血流とも血のクリアランスは浄化中細胞ペレットに赤血球の少量の存在によって明らかになると、絶対ではありません。したがって、単球や好中球の小さいレベルは共同浄化、単離細胞のトランスクリプトームのプロファイルに異なる署名の貢献。しかし、循環細胞無血清 TIC メディアですぐに死んでしまう、彼らは存続し、文化を含んでいる血清で増殖を続けることができますが、永続的な汚染物質を表しません。

健康的な実行可能な文化を達成するために別の重要なポイントは機械的解離手順中に世話をします。一方、douncing を殺す多くのニューロン、グリア細胞、およびその他中枢神経系細胞、ミクログリアは比較的無傷で (ただし、ミクログリアは、以上の douncing によって殺すことができる) この解離を生き残る。正しく行う場合、このプロトコルはセル利回り蛋白解離を使用して得られたものに匹敵する結果、高温反応を避ける一方、潜在的交絡変数を炎症性組織から。機械的組織解離の連続不完全なラウンドを実行すると、単一のセルは、全体的な文化の機械的ストレスの量を最小限に抑えながら、懸濁液から収穫できます。

ここで記述されている immunopanning プロトコルは、ミクログリアを分離するため信頼性が高く、再現性のある方法が、他の同等の方法があります。磁気活性化細胞ミエリンの枯渇と CD11b 選択範囲の並べ替えと磁気分離を使用して同様の結果を得た。ここに注力 immunopanning メソッドの日付に最高品質の文化を提供しているより特殊な機器が必要です、直前の培養細胞への鉄酸化された抗体の導入を必要としません。ミクログリアの分離のために一般的に使用される別のアプローチは、フローサイトメトリー、他 CD11b + 骨髄性汚染物質から表面を使用して善意のミクログリアの浄化のためのプロトコルが存在するという点で、現在のアプローチ上の大きな利点を持っています。TEMEM119⁸のような署名マーカーに対する抗体。蛍光活性化細胞ソーティング結果が非常に純粋なセル人口のもまたセルに追加のストレスを課すし、低い生存文化や還元利回りがあります。全体的にみて、再現性と細胞の純度を最大限にラベル無料密度遠心分離と振り払い準備上抗体を用いた方法に着目します。

幼若ラット ミクログリアの文化のため、このプロトコルを最適化しながら様々 な年齢層からミクログリアの培養に使える合計セルの利回りが最大 1 - 2 週齢ラット、ミクログリアの拡張のピークが過ぎた後から、古い組織から細胞の回復を妨げる構造の再構成する前に。ミクログリアの分離し、CD11b 抗体をマウスやヒトの抗原のために特定適切な抗体に置き換えることによってマウスやヒトの組織から培養もすることができます。これらの培養条件下でマウスと人間のミクログリアを生き残るため、彼らはラットの細胞と比較して形態学的差異を示します。マウス細胞は分岐された形態の保持がひと細胞がほぼ一様アメーバ形態と隔離され、この手順に従って培養プロセス、手の込んだ以下です。

孤立したミクログリアは、必要なアッセイに応じて異なる方法でめっきすることが。例のようにライブ/デッド試金およびここに示す形態の映画で) 最適な結果を得るのための³セルを 10 x 3.5 が「スポット」として IV コラーゲンの 10 分塗装後 24 ウェル アニオン ・ カチオン塗装組織培養プレートの井戸の中心部にメッキ上記のプロトコルで説明します。また、RNA の隔離などの細胞の多数を必要とする実験のため 3-5 x 10 の⁴セルめっきすることが/24 ウェル プレートのウェル コラーゲン IV コーティングの 1 時間 10 分後。セルが若干低い生存率を示したより高い密度でメッキ、おそらく分離への応答で分泌される炎症シグナルの影響によりスポットあった細胞と比較してより複雑な形態は扱われます。免疫組織化学またはガラス coverslips を必要とするイメージング、細胞を示す最高の生存と coverslips の最初頃の形態は歯根膜でコーティングし、前述のように IV 型コラーゲンでコーティングします。多数の条件を必要とするアッセイ、細胞生存率もコラーゲン被覆 384 ウェルまたは 96 ウェルのプレートで高いです。すべての条件で、細胞は円形またはバイポーラ開始、開始日 3-4、周りのプロセスを取得し、図 1と映画 1で示されている最大限に分岐し形態を展示する 5-10 日を取る。

このプロトコルは、動的監視行動とミクログリア生体内で休んでいるような形態を展示する文化の結果、これらの細胞は体内ミクログリアの特殊な遺伝子発現シグネチャを完全に保持する失敗します。培養細胞に見られた永続的な遺伝子の変更の多くは通常⁹胚性または炎症性中枢神経系に見られる変化が反映されます。など、このプロトコルは、ミクログリアが文化と血清誘発変更で生き残るために必要な条件の理解に一歩前進を表しますが、ミクログリアを微調整する中枢神経系によって提供される外因性の信号を理解するさらなる研究が必要プロパティと遺伝子発現。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.