رواية السلبي مسح أساليب للإنتاج السريع للشفافية الضوئية في كامل أنسجة الجهاز العصبي المركزي
Summary
نقدم هنا، منهجيات رواية اثنين وبسباكت و mPACT، لتحقيق أقصى حد من الشفافية الضوئية والتحليل المجهري اللاحقة للمفرج الأنسجة في القوارض سليمة كامل الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
منذ وضع الوضوح، بيويليكتروكهيميكال مسح تقنية تسمح لتعيين النمط الظاهري ثلاثية الأبعاد داخل أنسجة شفافة، العديد من منهجيات رواية المقاصة بما في ذلك مكعب (تصوير الدماغ واضحة ودون عائق الكوكتيل والتحليل الحسابي)، ميثاق (تقنية الوضوح السلبي)، وخريطة (تحليل المكبرة البروتين) والتبديل (مراقبة وقت تفاعل المنظومة) وحركية من المواد الكيميائية قد أنشئت مجموعة الأدوات القائمة لتوسيع التحليل المجهري للأنسجة البيولوجية. هذه الدراسة تهدف إلى تحسين بناء وتحسين الإجراء الأصلي للميثاق لمجموعة أنسجة القوارض سليمة، بما في ذلك كامل الجهاز العصبي المركزي (CNS) والكليتين والطحال والأجنة الماوس كله. وصف بسباكت (ميثاق عملية منفصلة) و mPACT (تعديل ميثاق)، توفر هذه التقنيات الجديدة وسيلة فعالة جداً لرسم خرائط الدوائر الخلية وتصور الهياكل سوبسيلولار في الأنسجة العادية والمرضية سليمة. في بروتوكول التالية، ونحن نقدم عرضاً تفصيلاً، خطوة بخطوة حول كيفية تحقيق إزالة الأنسجة القصوى مع الحد الأدنى من غزو سلامتهم الهيكلي عن طريق بسباكت و mPACT.
Introduction
هدفا أساسيا للتحقيق العلمي والسريري ويشمل تحقيق فهم كامل لهيكل الجهاز ووظيفة؛ ومع ذلك، غالباً ما تخدم طبيعة معقدة للغاية لأجهزة الثدييات كحاجز أمام تحقيق هذا الهدف1. يحقق الوضوح (تبادل “الدهن واضحة” تهجين الاكريلاميد جامدة المتوافقة مع تصوير تسسو-hYdrogel)2،3،4، الذي يشمل بناء هجين المائية القائمة على مادة اكريلاميد من أنسجة سليمة، إزالة البصرية لمجموعة متنوعة من الأجهزة، بما في ذلك الدماغ والكبد، والطحال، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية على5. وهكذا مكن الوضوح التصور ليس فقط ولكن أيضا الفرصة لتشريح ناعما الشبكات الخلوية المعقدة والأنسجة مورفولوجيس دون الحاجة لتمزيقها.
وبغية تحقيق إزالة الأنسجة، توظف الوضوح أساليب الغرواني الكهربي إزالة المحتوى الدهني للعينة في متناول اليد. بينما قد لوحظ الوضوح لإنتاج هجن المائية الأنسجة استقرارا ماديا، وقد أظهرت الدراسات أن استخدام أساليب المقاصة (إلخ) الأنسجة الغرواني الكهربي يثمر نتائج متغير من حيث نوعية الأنسجة، بما في ذلك براوننج، حانمه الضرر، و فقدان البروتين5،6. لمعالجة هذه القضايا، تم تعديل البروتوكولات مثل ميثاق (تقنية الوضوح السلبي)، الذي يحل محل العلاج إلخ مع تقنية ديليبيديشن استناداً إلى المبنى للمجهول، والمنظفات الأيونية، نمواً7،،من89. على الرغم من تحقيق قدر أكبر من اتساق في النتائج، بيد أن الميثاق يتطلب المزيد من الوقت للحصول على التصريح القصوى. وعلاوة على ذلك، أيا من هذه الأساليب بعد لم تطبق بشكل كامل الجهاز العصبي المركزي، أو في أكبر نماذج القوارض مثل الفئران وخنازير غينيا.
وتسعى الدراسة الحالية لمعالجة هذه القيود باقتراح منهجيات جديدة، بسباكت (ميثاق عملية منفصلة) و mPACT (تعديل ميثاق)، لتسهيل إزالة سريعة لكامل الجهاز العصبي المركزي والأجهزة الداخلية في نماذج الماوس وفار10. على وجه التحديد، بسباكت عمليات الأنسجة في الاكريلاميد 4% و 0.25% خامسا-044 في خطوتين منفصلة أثناء تشكيل المائية؛ mPACT أساسا ينطوي على نفس الخطوات ولكن يكمل الحل القائم على الحزب الديمقراطي الصربي المقاصة مع 0.5% α-ثيوجليسيرول ككاشف رئيسية. كلا أساليب تسخير نظم الدورة الدموية الجهازية واو الذاتية لخفض الوقت اللازم لإنتاج التخليص الضوئية. كدليل على المبدأ، نحن شرح استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] لتحليل أنماط الأوعية الدموية في الأنسجة المجازين10.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين استخدمت أساليب الاستخراج سلبية، غير الغرواني الكهربي في ميثاق تحسن كبير في اتساق تحقيقه مع الأنسجة السابقة تطهير الطرق مثل الوضوح2،3،،من47 , 8، التقنية لا تزال تحمل العديد من أوجه القصور، هو الأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المشروع “الدماغ كوريا 21 زائد” “العلوم الطبية”، جامعة يونسي هذا العمل. وبالإضافة إلى ذلك، كان يؤيد هذا العمل بمنحه من “مؤسسة البحوث الوطنية كوريا” (جبهة الخلاص الوطني-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
- Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
- Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
- Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
- Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).
