Romanzo passivo metodi di compensazione per la produzione rapida di trasparenza ottica nell'intero tessuto dello SNC
Summary
Qui, presentiamo due nuove metodologie, psPACT e MPATTO, per raggiungere la massima trasparenza ottica e la successiva analisi microscopica del sistema vascolare del tessuto nel roditore intatto tutta CNS.
Abstract
Poiché lo sviluppo di chiarezza, un bioelectrochemical tecniche di taglio che consente per la mappatura tridimensionale fenotipo all’interno dei tessuti trasparenti, una moltitudine di schiarimento romanzo metodologie tra cui CUBIC (imaging cerebrale chiaro, senza ostacoli cocktail e analisi computazionale), SWITCH (tutto il sistema di controllo del tempo di interazione) e cinetica di sostanze chimiche, mappa (ingrandita analisi del proteoma) e patto (tecnica passiva chiarezza), sono stati istituiti per espandere ulteriormente il toolkit esistente per l’analisi microscopica dei tessuti biologici. Il presente studio mira a migliorare e ottimizzare la procedura di patto originale per una matrice di tessuti roditore intatti, compreso l’intero sistema nervoso centrale (CNS), reni, milza ed embrioni del mouse intero. Denominato psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), queste nuove tecniche forniscono altamente efficace mezzo di mappatura circuito di cella e la visualizzazione di strutture subcellulari nei tessuti normali e patologici intatti. Nel seguente protocollo, forniamo un contorno dettagliate su come raggiungere la distanza massima del tessuto con l’invasione minima della loro integrità strutturale tramite psPACT e mPACT.
Introduction
Un obiettivo fondamentale di indagine scientifica e clinica coinvolge il raggiungimento di una completa comprensione della struttura dell’organo e funzione; Tuttavia, la natura estremamente complessa di organi mammiferi spesso funge da barriera per realizzare pienamente questo obiettivo1. CHIAREZZA (chiaro del lipido-scambiati acrilamide-ibridato rigida Imaging-compatibile tessutale-idrogel)2,3,4, che prevede la costruzione di un ibrido di idrogel a base di acrilammide dai tessuti intatti, raggiunge gioco ottico di una varietà di organi, compreso il cervello, il fegato e la milza, preservando la loro integrità strutturale5. CHIAREZZA così ha permesso non solo la visualizzazione, ma anche la possibilità di sezionare finemente complesse reti cellulari e morfologie di tessuto senza l’esigenza di sezionamento.
Al fine di ottenere la liquidazione del tessuto, chiarezza impiega i metodi elettroforetici per rimuovere il contenuto lipidico del campione a portata di mano. Mentre la chiarezza è stato notato per la produzione di ibridi fisicamente stabile del tessuto-idrogel, studi hanno dimostrato che l’uso di metodi di schiarimento (ecc) di tessuto elettroforetica produce risultati variabili in termini di qualità dei tessuti, tra cui browning, epitopo danni, e proteina perdita5,6. Per risolvere questi problemi, protocolli modificati come patto (passivo chiarezza tecnica), che sostituisce il trattamento ecc con una tecnica passiva, ionico-detergente delipidizzazione base, sono stati sviluppati7,8,9. Malgrado il raggiungimento di una maggiore coerenza nei risultati, tuttavia, il patto richiede più tempo per ottenere la massima altezza. Inoltre, nessuna di queste tecniche sono ancora stata applicata per l’intero modulo di CNS, o nei modelli più grandi roditori quali ratti e cavie.
Il presente studio cerca di affrontare queste limitazioni, proponendo nuove metodologie, psPACT (Patto di processo-separi) e mPACT (Patto modificata), per facilitare il gioco veloce del SNC intero e organi interni nel topo e ratto modelli10. In particolare, psPACT processi tessuti in 4% di acrilammide e 0,25% VA-044 in due passaggi separati durante la formazione di idrogel; MPATTO essenzialmente coinvolge la stessa procedura, ma integra la soluzione basata su SDS schiarimento con 0,5% α-thioglycerol come reagente chiave. Entrambe le tecniche sfruttano sistemi circolatorio sistemici e cerebrospinali endogeni per ridurre significativamente il tempo necessario per produrre gioco ottico. Come prova di principio, dimostriamo l’uso della microscopia confocale per analizzare modelli di vaso sanguigno nei tessuti sgomberati10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre i metodi di estrazione passivo, elettroforesi-impiegato nel patto ha migliorato significativamente la consistenza realizzata con tessuto precedente schiarimento metodi ad esempio chiarezza2,3,4,7 , 8, la tecnica porta ancora varie carenze, la più urgente delle quali è la lunghezza del tempo necessario per raggiungere il tessuto massima chiarezza<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal progetto cervello Corea 21 PLUS per la scienza medica, Università di Yonsei. Inoltre, questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
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