Summary

Roman pasif optik şeffaflık bütün sinir dokusunda hızlı üretim için yöntemleri Temizleme

Published: May 08, 2018
doi:

Summary

Burada, iki roman metodolojisi, psPACT ve mPACT maksimal optik şeffaflık ve doku damarlara sağlam kemirgen sonraki mikroskobik analizi elde etmek için mevcut tüm CNS.

Abstract

NETLİK geliştirme beri teknik temizleyerek bir bioelectrochemical bu üç boyutlu fenotip eşleme için şeffaf dokularda, roman Temizleme yöntemleri kübik (açık, engelsiz beyin görüntüleme dahil olmak üzere çok sayıda sağlar kokteyller ve sayısal analiz), anahtarı (etkileşim zaman sistemde kontrol) ve kimyasal kinetik, harita (Proteom büyütülmüş analizi) ve PAKTI (pasif netlik tekniği), kurulmuştur için varolan araç daha fazla genişletmek için biyolojik dokuların mikroskopik analiz. Üzerine iyileştirmek ve özgün PAKTI yordamı tüm merkezi sinir sistemi (MSS), böbrek, dalak ve tüm fare embriyo gibi sağlam kemirgen dokuların bir dizi için en iyi duruma getirme mevcut çalışma amaçlamaktadır. PsPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI) olarak adlandırdığı, roman bu teknikler hücre devresi haritalama ve olduğu gibi normal ve patolojik dokularda hücre altı yapıları görselleştirme son derece etkili yol sağlar. Aşağıdaki iletişim kuralında, biz onların yapısal bütünlük psPACT ve mPACT üzerinden en az işgali ile maksimal doku izni elde etmek nasıl ayrıntılı, adım adım anahat sağlar.

Introduction

Klinik ve bilimsel açıdan soruşturma temel amacı organ yapısı ve fonksiyonu tam bir anlayış ulaşmak içerir; Ancak, memeli organları son derece karmaşık doğası kez tamamen bu amaç1ulaşmak için bir engel olarak hizmet vermektedir. Sağlam dokulara gelen bir hidrojel Akrilamid tabanlı melez inşa içerir, berraklık (açık Lipid değiş tokuş Akrilamid melezleşmiştir katı görüntüleme uyumlu Tisssue-hidrojel)2,3,4, elde organ, beyin, karaciğer ve dalak, onların yapısal bütünlük5koruyarak dahil olmak üzere çeşitli optik geçiş izni. NETLİK böylece sadece görselleştirme ince karmaşık hücresel ağlar ve doku türleri Morfoloji kesit gerek kalmadan incelemek için bir fırsat aynı zamanda sağlamıştır.

Doku izni elde etmek için NETLİK örnek el altında lipit içeriğini kaldırmak için elektroforetik yöntemleri kullanır. NETLİK fiziksel olarak istikrarlı doku-hidrojel melez üretmek için kaydetti iken, elektroforetik doku takas (vb) yöntemleri kullanımı, esmerleşme epitope hasar, dahil olmak üzere, doku kalitesi açısından değişken sonuçlar verir çalışmalar göstermiştir ve protein kaybı5,6. Bu sorunları gidermek için vb tedavi yerini alan bir pasif, deterjan iyonik bağlı delipidation tekniği ile anlaşma (pasif netlik tekniği), gibi değiştirilmiş protokolleri gelişmiş7,8,9olmuştur. Sonuçlarında büyük bir tutarlılık ulaşmak rağmen ancak, PAKTI maksimal izni elde etmek için daha fazla zaman gerektirir. Ayrıca, bu teknikleri hiçbiri henüz tüm CNS formu veya fareler ve eskiden şiling şimdi pigs gibi daha büyük kemirgen modellerinde uygulandı.

Bu da çalışmanın roman metodolojileri, psPACT (işlem-ayrı PAKTI) ve mPACT (değiştirilmiş PAKTI), Bütün CNS ve iç organlar fare ve sıçan modelleri10hızlı Gümrükleme kolaylaştırmak için teklif tarafından bu sınırlamaları gidermek çalışmaktadır. Özellikle, psPACT % 4 Akrilamid ve % 0.25 dokulara işleyen VA-044 hidrojel oluşumu sırasında; iki ayrı adımda mPACT esasen aynı adımları içerir, ancak % 0.5 α-thioglycerol anahtar reaktifi olarak SDS tabanlı takas Çözümle takviyeleri. Her iki teknikleri endojen sistemik ve cerebrospinal dolaşım optik temizleme üretmek için gereken süreyi önemli ölçüde azaltmak için sistemleri koşum. İlke kanıtı olarak biz confocal mikroskopi kan damarı desenleri temizlenen doku10analiz kullanımını göstermektedir.

Protocol

Tüm yordamları Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, uygun araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm deneysel hayvan laboratuvar hayvan bakımı Komitesi Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi, kuralları uyarınca feda etti. 1. hazırlanması reaktifler Dikkat: Paraformaldehyde (PFA), Akrilamid ve Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) toksik tahriş edici vardır ve böylece bir duman başlıklı uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE; önlük, eldiven, koruyucu…

Representative Results

En iyi duruma getirilmiş pasif Temizleme teknikleri kullanarak tüm CNS şeffaf bir model nesil Fare ve sıçan bütün CNS dokuların optik geçiş izni hızla çeşitli pasif Temizleme Teknikleri (şekil 1) kullanılarak sağlanır. Zaman içinde takas dokusunun bir şematik şekil 2Agösterilir. Özgün PAKTI yönteminden farklı olarak, % 4 Akrilam…

Discussion

Pasif, elektroforetik sigara ekstraksiyon yöntemleri istihdam ederken PAKTI önceki doku NETLİK2,3,4,7 gibi yöntemleri temizlenmesi ile elde tutarlılık önemli ölçüde geliştirilmiş , 8, teknik hala birkaç eksiklikler, maksimal doku netlik12ulaşmak için gereken süreyi en önemli biri olduğunu taşımaktadır. Mevcut çalı…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Tıp bilimi, Yonsei Üniversitesi beyin Kore 21 artı proje tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak, bu eser Ulusal Araştırma Vakfı Kore (NMK-2017R1D1A1B03030315) bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix, Inc. 75819 Clearing solution
Nycodenz Axia-Shield 1002424 nRIMS solution
40% Acrylamide Solution Bio Rad Laboratories, Inc. 161-0140 Polymerization (A4P0)
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 017-19362 Polymerization (VA-044)
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753-100ML Clearing solution (mPACT)
Tween-20 Georgiachem 9005-64-5 nRIMS solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML Immuno Staining
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSA100 Immuno Staining
Heparin Merck Millipore 375095 Perfusion (PBS)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G nRIMS solution
PECAM-CD31 antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-28188 Immuno Staining
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate Jackson ImmunoResearch Inc. 111-165-003 Immuno Staining
4% Paraformaldehyde Tech & Innovation BPP-9004 Perfusion, Polymerization
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) Tech & Innovation BPB-9121 Perfusion, Buffer
10 mL stripette Coatar 4488 Solution transfer
50 mL tube Falcon 352070 Clearing tube
35 mm Cell culture dish SPL 20035 Imaging
Confocal dish SPL 211350 Imaging
1 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 26G 1/2 Anesthetize 
50 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 21G1 1/4 Perfusion
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 Polymerization (A4P0)
Whatman 3MM paper Sigma-Aldrich Z270849 Blotting paper for gel removal
Confocal microscope Zeiss LSM780 Imaging
ZEN lite Software Zeiss ZEN 2012 Imaging
Peristaltic pump Longerpump BT100-1F Perfusion
EasyGel Lifecanvas Technologies EasyGel Tissue gel hybridization system

References

  1. Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience. Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  3. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  4. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
  5. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
  6. Jensen, K. H. R., Berg, R. W. Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY. J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).
  7. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
  8. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  9. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
  10. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).
  11. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  12. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  13. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  14. Choi, B. R., et al. Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Exp Mol Med. 46, 75 (2014).
  15. Chang, D. J., et al. Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats. Exp Mol Med. 45, 53 (2013).
  16. Kim, T. K., et al. Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease. Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).
  17. Kinameri, E., et al. Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis. PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).

Play Video

Cite This Article
Woo, J., Lee, E. Y., Park, H., Park, J. Y., Cho, Y. E. Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue. J. Vis. Exp. (135), e57123, doi:10.3791/57123 (2018).

View Video