一种新的用于全中枢神经系统光透明快速生成的无源清除方法
Summary
在这里, 我们提出了两个新的方法, psPACT 和 mPACT, 以实现最大的光学透明度和随后显微分析的组织血管在完整的啮齿动物整个中枢神经系统。
Abstract
由于清晰度的发展, 一种电化学清除技术, 允许在透明组织内的三维表型映射, 多种新的清除方法, 包括立方 (清晰, 无障碍的脑成像鸡尾酒和计算分析), 开关 (系统范围控制的交互时间和化学动力学的化学品), 地图 (放大分析的蛋白质组) 和协议 (被动清晰度技术), 以进一步扩大现有的工具箱生物组织的显微分析。本研究旨在改进和优化原始的协议程序, 为一系列完整的啮齿动物组织, 包括整个中枢神经系统 (CNS), 肾脏, 脾脏, 和整个小鼠胚胎。这些新的技术被称为 psPACT (过程分离协议) 和 mPACT (修改后的契约), 提供了非常有效的方法来映射细胞电路, 并在完整的正常和病理组织中可视化亚型结构。在下面的协议中, 我们提供了一个详细的, 分步概述如何实现最大的组织间隙, 最小的入侵他们的结构完整性通过 psPACT 和 mPACT。
Introduction
科学和临床调查的一个基本目标是全面了解器官结构和功能;然而, 哺乳动物器官极其复杂的性质往往是完全实现这一目标的障碍1。清晰度 (透明脂交换丙烯酰胺-杂交刚性成像兼容 Tisssue-水凝胶)2,3,4, 其中包括建立一个基于丙烯酰胺的水凝胶混合从完整的组织, 达到各种器官的光学清除, 包括大脑、肝脏和脾脏, 同时保持其结构完整性5。因此, 清晰度不仅使可视化, 而且还有机会精细解剖复杂的细胞网络和组织形态, 而不需要切片。
为了达到组织间隙, 清晰度采用电泳方法去除手上样品的脂质含量。虽然已注意到生产物理稳定的组织-水凝胶杂交种, 研究表明, 其使用电泳组织清除 (等) 方法产生可变的结果, 在组织质量方面, 包括褐变, 表位损害, 和蛋白质损失5,6。为了解决这些问题, 已开发了7、8、9等修改的协议 (被动清晰度技术), 取代了被动的、基于离子洗涤剂的 delipidation 技术等处理。然而, 尽管在结果上取得了更大的一致性, 但条约需要更多的时间来获得最大的清除。此外, 这些技术尚未应用到整个中枢神经系统的形式, 或大鼠模型, 如老鼠和豚鼠。
本研究试图通过提出新的方法、psPACT (过程分离的公约) 和 mPACT (修改后的公约) 来解决这些限制, 以促进在老鼠和老鼠模型中的整个中枢神经系统和内脏器官的快速清除10。具体地说, psPACT 在水凝胶形成过程中分别在4% 丙烯酰胺和 0.25% VA-044 的两个步骤中处理组织;mPACT 基本上涉及相同的步骤, 但补充了基于 SDS 的清除解决方案与0.5% α thioglycerol 作为关键试剂。这两种技术都利用了内源系统和脑脊液循环系统, 大大减少了产生光间隙所需的时间。作为一项原则的证明, 我们展示了使用共焦显微镜分析在清除组织中的血管模式10。
Protocol
Representative Results
Discussion
尽管在协议中使用的被动、非电泳提取方法大大提高了与以前的组织清除方法一致的一致性, 如清晰度2、3、4、7,8, 该技术仍然存在几个缺点, 其中最紧迫的是实现最大组织清晰度12所需的时间长度。在当前的研究中, 我们提出了修改的协议协议, 大大减少了?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了大脑韩国21加 Yonsei 大学医学科学项目的支持。此外, 这项工作得到了韩国国家研究基金会 (NRF-2017R1D1A1B03030315) 的赠款的支持。
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
References
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