Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS
Summary
Nous présentons ici deux nouvelles méthodes, psPACT et mPACT, pour réaliser la transparence optique maximale et l’analyse microscopique ultérieure de la vascularisation des tissus chez le rongeur intact entier CNS.
Abstract
Depuis la mise au point de clarté, une bioelectrochemical technique de compensation qui permet pour la cartographie en trois dimensions de phénotype au sein des tissus transparents, une multitude de méthodes de compensation roman notamment cubique (l’imagerie cérébrale claire et dégagée cocktails et analyse computationnelle), SWITCH (contrôle systémique du temps de l’interaction) et la cinétique des produits chimiques, carte (grossie analyse du protéome) et Pacte (technique de clarté passive), ont été établis afin d’accroître la boîte à outils existant pour l’analyse microscopique des tissus biologiques. La présente étude vise à améliorer et optimiser la procédure initiale de Pacte pour une gamme de tissus de rongeurs intacts, y compris l’ensemble du système nerveux central (CNS), les reins, rate et des embryons de souris tout. Appelé psPACT (Pacte de processus-Remscheid) et mPACT (mis à jour le Pacte), ces nouvelles techniques fournissent des moyens très efficaces de cartographie des circuits de cellules et la visualisation des structures subcellulaires dans les tissus normaux et pathologiques intacts. Dans le protocole suivant, nous fournissons un aperçu détaillé, étape par étape sur comment réaliser le dégagement maximal tissu avec atteinte minimale à leur intégrité structurale via psPACT et mPACT.
Introduction
Des objectifs fondamentaux de l’enquête scientifique et clinique consiste à atteindre une compréhension complète de la structure de l’organe et la fonction ; Toutefois, la nature extrêmement complexe d’organes chez les mammifères sert souvent de barrière pour atteindre pleinement cet objectif1. CLARTÉ (lipides claire-échangé hybridé Acrylamide rigide compatible avec l’imagerie violets-hYdrogel)2,3,4, qui prévoit la construction d’un hybride d’hydrogel axée sur l’acrylamide de tissus intacts, réalise espace optique de divers organes, y compris le cerveau, le foie et la rate, tout en préservant leur intégrité structurale5. CLARTÉ a ainsi permis de non seulement visualisation, mais aussi l’occasion de disséquer finement les réseaux cellulaires complexes et morphologies de tissus sans la nécessité pour le sectionnement.
Afin de réaliser le dégagement de tissu, clarté emploie des méthodes électrophorétiques pour éliminer la teneur en lipides de l’échantillon à portée de main. Alors que la clarté a été notée pour produire des hybrides de tissu-hydrogel physiquement stable, des études ont montré que son utilisation des méthodes de compensation (etc.) tissu électrophorétique donne des résultats variables en termes de qualité de tissus, y compris le brunissement, épitope dommage, et protéine perte5,6. Pour résoudre ces problèmes, les protocoles modifiés tels que le Pacte (Technique PAssive de clarté), qui remplace le traitement ETC avec une technique de délipidation fonction passive, ionique-détergent, ont été développés7,8,9. Malgré la réalisation d’une plus grande cohérence dans les résultats, cependant, Pacte exige plus de temps pour obtenir l’autorisation maximale. En outre, aucune de ces techniques ont encore été appliqué à la forme de CNS entier, ou dans des modèles plus grands rongeurs comme les rats et les cobayes.
La présente étude vise à pallier ces lacunes en proposant de nouvelles méthodes, psPACT (Pacte de processus-Remscheid) et mPACT (mis à jour le Pacte), pour faciliter le dégagement rapide de la CNS entier et des organes internes à la souris et le rat modèles10. Plus précisément, psPACT traite les tissus à 4 % d’acrylamide et 0,25 % VA-044 en deux étapes distinctes au cours de la formation de l’hydrogel ; mPACT essentiellement basée sur les mêmes étapes, mais complète la solution de compensation basée sur SDS avec 0,5 % α-thioglycérol comme un réactif de clés. Les deux techniques d’exploiter les systèmes circulatoires systémiques et céphalo-rachidien endogènes pour réduire considérablement le temps nécessaire pour produire la clairance optique. Comme une preuve de principe, nous montrent l’utilisation de la microscopie confocale à analyser les tendances des vaisseaux sanguins dans les tissus dégagé10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que les méthodes d’extraction passive, non-électrophorétique employées dans Pacte amélioré de manière significative la consistance obtenue avec tissu précédent compensation des méthodes telles que clarté2,3,4,7 , 8, la technique porte encore plusieurs lacunes, les plus pressants dont sont la longueur du temps nécessaire pour atteindre les t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le projet cerveau Corée 21 avec pour la Science médicale, Université de Yonsei. En outre, ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (FRO-2017R1D1A1B03030315).
Materials
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix, Inc. | 75819 | Clearing solution |
| Nycodenz | Axia-Shield | 1002424 | nRIMS solution |
| 40% Acrylamide Solution | Bio Rad Laboratories, Inc. | 161-0140 | Polymerization (A4P0) |
| 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 017-19362 | Polymerization (VA-044) |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753-100ML | Clearing solution (mPACT) |
| Tween-20 | Georgiachem | 9005-64-5 | nRIMS solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | Immuno Staining |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSA100 | Immuno Staining |
| Heparin | Merck Millipore | 375095 | Perfusion (PBS) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | nRIMS solution |
| PECAM-CD31 antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-28188 | Immuno Staining |
| Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate | Jackson ImmunoResearch Inc. | 111-165-003 | Immuno Staining |
| 4% Paraformaldehyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | Perfusion, Polymerization |
| 20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) | Tech & Innovation | BPB-9121 | Perfusion, Buffer |
| 10 mL stripette | Coatar | 4488 | Solution transfer |
| 50 mL tube | Falcon | 352070 | Clearing tube |
| 35 mm Cell culture dish | SPL | 20035 | Imaging |
| Confocal dish | SPL | 211350 | Imaging |
| 1 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 26G 1/2 | Anesthetize |
| 50 mL syringe | Korea vaccine Co., Ltd | 21G1 1/4 | Perfusion |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A3553 | Polymerization (A4P0) |
| Whatman 3MM paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | Blotting paper for gel removal |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Imaging |
| ZEN lite Software | Zeiss | ZEN 2012 | Imaging |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-1F | Perfusion |
| EasyGel | Lifecanvas Technologies | EasyGel | Tissue gel hybridization system |
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