Canalostomy comme une approche chirurgicale pour la livraison de drogue Local dans l’oreille interne de souris adultes et néonatales
Summary
Nous décrivons ici la procédure canalostomy qui permet la livraison de drogue local dans l’oreille interne de souris adultes et néonatales par le biais du canal semicirculaire avec le minimum de dommages à fonction auditif et vestibulaire. Cette méthode peut être utilisée pour inoculer des vecteurs viraux, de produits pharmaceutiques et de petites molécules dans l’oreille interne de la souris.
Abstract
Remise locale de médicaments thérapeutiques dans l’oreille interne est une thérapie prometteuse pour les maladies de l’oreille interne. Injection à travers les canaux semi-circulaires (canalostomy) s’est avérée être une approche utile pour l’administration de médicaments locaux dans l’oreille interne. L’objectif de cet article est de décrire, en détail, les techniques chirurgicales impliquées dans la canalostomy chez les souris adultes et néonatales. Indiqué par fast-vert colorant et adeno-associated virus de sérotype 8 avec le gène de la protéine fluorescente verte, la canalostomy a facilité la large distribution de réactifs injectées dans la cochlée et extrémité-organes vestibulaires avec un minimum de dommages à l’audience et fonction vestibulaire. La chirurgie a été implementée avec succès chez des souris adultes et néonatales ; en effet, plusieurs chirurgies pourraient être réalisées si nécessaire. En conclusion, canalostomy est une approche efficace et sécuritaire d’administration des médicaments dans l’oreille interne de souris adultes et néonatales et peut être utilisé pour traiter les maladies de l’oreille interne humaine dans le futur.
Introduction
Neuro-sensorielle auditive perte et dysfonctionnement vestibulaire affecte un nombre important de patients et sont étroitement associés aux troubles de l’oreille interne. Livraison de médicaments thérapeutiques dans l’oreille interne est prometteuse pour le traitement des troubles de l’oreille interne. Une approche systémique ou locale permet de livrer des médicaments dans l’oreille interne. Certaines maladies de l’oreille interne sont traités avec succès avec l’administration systémique de médicaments, tels que la perte auditive soudaine idiopathique, qui est généralement traitée par stéroïdes systémiques1. En outre, Lentz et coll. ont montré que l’administration systémique d’oligonucléotides antisens a pu améliorer l’audition et l’équilibre des fonctions dans le modèle de souris mutantes Ush1c2. Cependant, une grande partie des maladies de l’oreille interne ne sont pas traité efficacement par l’administration systémique de médicaments en raison de la barrière sang-labyrinthe, qui limite l’accès aux médicaments à l’oreille interne3,4. En revanche, stratégies d’administration locale de médicaments peuvent traiter les troubles de l’oreille interne plus efficacement. En effet, l’oreille interne est potentiellement une cible idéale pour la livraison de drogue local ; Il est rempli de liquide, ce qui facilite la diffusion de la drogue après la diffusion d’un site ou injection, et il est relativement isolé des organes voisins, ce qui limite les effets secondaires5,6.
Stratégies d’administration locale de médicaments incluent les méthodes intratympanic et intralabyrinthine. L’efficacité de l’itinéraire intratympanic repose en grande partie sur la perméabilité de la drogue à travers la membrane de la fenêtre ronde (RWM) et le temps de résidence de la drogue sur le RWM3,4,7,8. Ainsi, il ne convient pas pour la livraison des médicaments ou des réactifs qui ne peut pas pénétrer le RWM. Intralabyrinthine méthodes impliquent l’inoculation des médicaments directement dans l’oreille interne, ce qui entraîne une dose élevée et une large diffusion. Cependant, intralabyrinthine méthodes nécessitent des chirurgies délicates et sont envahissantes, menant à dommage à l’oreille interne fonction. Actuellement, l’injection intralabyrinthine de médicaments est utilisée uniquement dans les études chez l’animal comme il n’a pas été démontré d’être suffisamment sûr pour l’usage dans les humains9. Par conséquent, interventions chirurgicales doivent être simplifiées, et le risque de blessures réduit à traduire intralabyrinthine approches à l’infirmerie.
Plusieurs approches intralabyrinthine ont été évaluées chez les animaux par injection dans le RWM5,10,11 , puis dans la scala media12,13,14, la scala tympanique 15 , 16, la scala vestibule17, les canaux semi-circulaires16,18,19,20et le sac endolymphatique21. Chacune de ces approches a des avantages et des inconvénients6. Livraison à travers le RWM est atraumatique en souris néonatales5,22. Cependant, une légère déficience auditive est observée chez les souris adultes après injection RWM23, probablement à cause de l’oreille moyenne épanchement après la chirurgie24. Injection de médias de Scala, qui consiste en l’injection de réactif directement dans le compartiment endolymphatique contenant l’épithélium sensoriel, permet d’obtenir une concentration élevée de réactif en cible fin-organes12,14, 25 , 26. Toutefois, cette approche nécessite une procédure compliquée et se traduit par une augmentation significative du seuil audience si effectué au plus tard le jour post-natal 5 (P5)25,27, ce qui limite son application.
Par rapport aux approches susmentionnées intralabyrinthine, canalostomy provoque un minimum de dommages à l’oreille interne, en particulier dans les souris adultes16,18,28,29,30, qui est important pour l’évaluation des effets protecteurs et aspects translationnelles. En outre, chez les rongeurs, les canaux semi-circulaires sont situés au-delà de la bulla, qui facilite les interventions chirurgicales et évite les perturbations de l’oreille moyenne pendant la chirurgie. Dans la clinique, canal semicirculaire chirurgies sont utilisés pour insolubles vertige positionnel paroxystique Bénin31,32,33, ce qui suggère la faisabilité clinique de canalostomy. Puisqu’elle a été décrite par Kawamoto et al. 16 en 2001, canalostomy a été utilisé pour livrer les différents réactifs, tels que les vecteurs viraux, siRNA, cellules souches et aminoside, dans la murine oreille interne18,19,28,29 ,34,35,36,37. L’inoculation des vecteurs de virus adeno-associated virus (AAV) par canalostomy permettent la surexpression d’un gène exogène dans l’épithélium sensoriel et neurones primaires de la cochlée et extrémité-organes vestibulaires18,28, 29,,30. Whirlin thérapie génique par canalostomy restaure la fonction balance et améliore l’audition dans un modèle murin d’humain Usher syndrome19, ce qui laisse supposer que canalostomy est utile pour l’étude de la thérapie génique pour les maladies génétiques cochléovestibulaire. Transplantation de cellules souches mésenchymateuses de canalostomy se traduit par la réorganisation des fibrocytes cochléaires et récupération d’audience dans un modèle de rat de perte auditive neurosensorielle aiguë35. En outre, canalostomy peut être utilisé pour introduire des aminosides dans l’oreille interne pour établir les lésions vestibulaires18,34,38, et plusieurs injections peuvent être effectuées si nécessaire18 , 34.
Dans le présent article, nous décrivons en détail, canalostomy techniques chez les souris adultes et néonatales. Nous avons inoculé différents réactifs, y compris le colorant vert rapide et sérotypes d’AAV 8 (AAV8), ainsi que le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) (AAV8-GFP) et à la streptomycine, dans l’oreille interne de la souris afin d’évaluer les résultats immédiats et à long terme après canalostomy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons montré que les medicaments par canalostomy donné lieu à une large diffusion du réactif tout au long de la cochlée et extrémité-organes vestibulaires. Comme une méthode de livraison de gène oreille interne, canalostomy a entraîné dans l’expression de la GFP dans l’oreille interne de souris adultes et néonatales avec le minimum de dommages à fonction auditif et vestibulaire. En outre, les injections multiples peuvent être facilement effectuées chez le même animal.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention numéros 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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