成人および新生児マウス内耳への薬剤の局所投与への外科的アプローチとしての Canalostomy
Summary
ここで我々 は聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで半規管を介して成人および新生児マウスの内耳への薬剤の局所投与を可能にする canalostomy の手順をについて説明します。このメソッドは、マウス内耳へのウイルスのベクトル、医薬・小分子を接種する使用ことができます。
Abstract
内耳に治療薬の局所投与は、内耳疾患に対する有望な治療法です。半規管 (canalostomy) を注入は、内耳への薬剤の局所投与に有用なアプローチをする示されています。この記事の目的は、について、詳しく説明、成人と新生児の両方のマウスの canalostomy に関与する手技です。蝸牛と前庭のエンドの聴覚に損傷が少なく臓器で注入された試薬の広範な分布を容易に、canalostomy として高速グリーン色素と緑色蛍光タンパク質遺伝子をアデノ随伴ウイルス血清型 8 によって示されると前庭の機能。成人および新生児マウス; 手術が実施されました確かに、必要な場合は、複数の手術を実行でした。結論としては、canalostomy は成人および新生児マウス内耳に薬物送達への効果的かつ安全なアプローチで、将来的に人間の内耳疾患を治療に使用することがあります。
Introduction
難聴と前庭機能障害に影響を与える患者の相当な数を密接に感音難聴内耳障害に関連付けられています。内耳への治療薬の配達は、内耳障害の治療のための約束を示しています。全身またはローカル アプローチは、内耳に薬を提供する使用できます。いくつかの内耳疾患は、突発性難聴、全身ステロイド1と扱われる一般的などの全身性の薬物投与による正常に扱われます。さらに、レンツらはアンチセンス オリゴヌクレオチドの全身投与は難聴を改善し、バランスの Ush1c 突然変異体マウス モデル2で機能することを示した。ただし、内耳疾患の大部分が効果的に扱われません全身投与による内耳の3,4薬へのアクセスを制限する血液迷路障壁のため。対照的に、局所薬物配送戦略は内耳障害をより効率的に扱うことができます。確かに、内耳は潜在的薬剤の局所投与; の理想的なターゲット1 サイトの拡散や注射後薬の普及を促進する液体でみたされている、それは比較的孤立した隣接臓器から副作用5,6を制限します。
局所薬物配送戦略鼓と intralabyrinthine のメソッドがあります。鼓の経路の有効性は大きく薬物透過 RWM3,4,7,8薬の滞留時間と丸い窓膜 (RWM) に依存します。したがって、薬物や、RWM を突き通すことができない試薬の配信に適したはありません。Intralabyrinthine 方法は、薬の高用量との広範な分布の結果、内耳に直接接種を含みます。ただし、intralabyrinthine 方法は繊細な手術を必要とし、侵略的、内耳機能へのダメージに 。現在、人間9で使用するため十分に安全であることは実証されていないと、intralabyrinthine 注射薬は動物実験でのみ使用されます。したがって、手術の手順を簡略化する必要がありますと怪我のリスク低減、クリニックに intralabyrinthine アプローチを翻訳します。
RWM5,10、11 scala メディア12,13,14スカラー座索注入による動物のいくつかの intralabyrinthine アプローチが評価され15,16、スカラー座附17、18,16,2019,半規管、および内リンパ嚢21。それぞれのアプローチには長所と短所6。RWM による配信は、新生児マウス5,22の非外科的です。ただし、軽度の聴力損失は RWM 注入23、中耳手術24後胸水のため後成体マウスで観察されます。感覚上皮を含む内の空間に直接試薬の注入が含まれます、Scala 媒体注入ターゲット エンド臓器12,14,の高い試薬濃度を実現します。25,26。 このアプローチ複雑な手順が必要ですし、生後 5 (P5) よりも後に実行された場合、聴覚閾値の有意な上昇の結果25,は27、そのアプリケーションを制限します。
Canalostomy は特に成体マウス16,18,28,29,30である内側の耳に与えるダメージを最小限を引き起こす intralabyrinthine の上記のアプローチと比較して、保護効果と並進の側面の評価にとって重要です。さらに、齧歯類では半規管は肺嚢胞手術を容易にし、手術中に中耳の障害を回避する以外にあります。クリニック、半規管の手術では、難治性良性発作性頭位めまい症31,32,33, canalostomy の臨床的可能性を示唆しているが使用されます。以来、まず、河本らによって記述されていた。マウス内耳18,19,28,29 にウイルスのベクトル、siRNA、幹細胞は、アミノグリコシド系などの様々 な試薬を提供する16年では、canalostomy が使用されています ,34,35,36,37。Canalostomy によるアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターの接種感覚上皮における外来遺伝子の過剰発現と蝸牛と前庭エンドの臓器18,28,の一次ニューロンの特性を有効にする29,30。Canalostomy による遺伝子治療を有バランス機能を復元し、人間アッシャー症候群19、その canalostomy が cochleovestibular の遺伝的疾患に対する遺伝子治療の研究に有用のマウスモデルで聴覚を向上させます。Canalostomy による間葉系幹細胞の移植は、蝸牛線維細胞と急性の感音難聴の聴力損失35のラットモデルにおける聴力回復の再編成の結果します。また、前庭神経病変18,34,38, を確立する内耳にアミノグリコシド系抗生物質を導入する canalostomy を使用できます、18を必要な場合、複数の注射を実行できます。,34。
本稿で述べる、成人および新生児マウスにおける canalostomy 技術。緑色蛍光タンパク質 (GFP) 遺伝子 (AAV8-GFP) とストレプトマイシン、高速グリーン色素と AAV 血清型 8 (AAV8) などを含むさまざまな試薬を接種したマウス内耳 canalostomy 後即時および長期的な成果を評価するために。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究で我々 は canalostomy による薬物が蝸牛と前庭エンドの臓器全体で試薬の広範な分布の結果を示した。内耳遺伝子配達方法として canalostomy は、聴覚と前庭の機能に最小限のダメージで成人と新生児マウスの内側の耳の GFP 発現をもたらした。さらに、同じ動物の複数の注射を簡単に実行できます。
Canalostomy の最大の強みの 1 つは、成体マウス16,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、中国の国家自然科学基金 (許可番号 81570912、81771016、81100717) によって支えられました。
Materials
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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