Canalostomy como un abordaje quirúrgico a la entrega del Local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y Neonatal
Summary
Aquí describimos el procedimiento de canalostomy que permite la entrega del local de la droga en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales a través del canal semicircular con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Este método puede utilizarse para inocular vectores virales, productos farmacéuticos y pequeñas moléculas en el oído interno de ratón.
Abstract
Entrega local de fármacos terapéuticos en el oído interno es una terapia prometedora para las enfermedades del oído interno. Inyección a través de los canales semicirculares (canalostomy) ha demostrado ser un método útil para la entrega local de la droga en el oído interno. El objetivo de este artículo es describir, detalladamente, las técnicas quirúrgicas en canalostomy en ratones adultos y neonatales. Como se indica por tinte de fast-green y virus adeno-asociado del serotipo 8 con el gen de la proteína verde fluorescente, el canalostomy facilitado amplia distribución de los reactivos inyectados en la cóclea y final-órganos vestibulares con mínimo daño a la audición y Función vestibular. La cirugía se implementó con éxito en ratones adultos y neonatales; de hecho, podrían realizarse múltiples cirugías si es necesario. En conclusión, canalostomy es un enfoque eficaz y seguro para el suministro de medicamentos en los oídos interiores de ratones adultos y neonatales y puede ser utilizado para tratar las enfermedades del oído interno humano en el futuro.
Introduction
Neurosensorial auditiva pérdida y disfunción vestibular afectan un número importante de pacientes y están estrechamente asociados con los trastornos del oído interno. Entrega de medicamentos en el oído interno muestra promisorio para el tratamiento de los trastornos del oído interno. Un enfoque sistémico o local puede utilizarse para administrar medicamentos en el oído interno. Algunas enfermedades del oído interno son tratados con éxito con medicamentos sistémicos, tales como hipoacusia súbita idiopática, que es comúnmente tratado con esteroides sistémicos1. Además, Lentz et al demostró que la administración sistémica de oligonucleótidos antisentido fue capaz de mejorar la audición y equilibrio de funciones en el ratón mutante Ush1c modelo2. Sin embargo, una gran parte de enfermedades del oído interno no son efectivamente tratadas por administración sistémica de medicamentos debido a la barrera del sangre-laberinto, que limita el acceso de drogas al oído interno3,4. En cambio, estrategias de entrega local de la droga pueden tratar trastornos del oído interno más eficiente. De hecho, el oído interno es potencialmente un objetivo ideal para la entrega local de la droga; está lleno de líquido, que facilita la difusión de la droga después de un sitio difusión o de inyección, y está relativamente aislada de órganos vecinos, que limita los efectos secundarios5,6.
Estrategias de entrega de drogas locales incluyen métodos intratimpánica y intralabyrinthine. La efectividad de la vía intratimpánica en gran parte depende de permeabilidad del fármaco a través de la membrana de ventana redonda (RWM) y el tiempo de permanencia del fármaco en el RWM3,4,7,8. Así, no es conveniente para la entrega de medicamentos o de reactivos que no pueden penetrar el RWM. Intralabyrinthine métodos implican la inoculación de drogas directamente en el oído interno, lo que resulta en una dosis alta y amplia distribución. Sin embargo, métodos intralabyrinthine requieren cirugías delicadas y son invasivos, resultando en daños a la función del oído interno. Actualmente, la inyección intralabyrinthine de drogas sólo se utiliza en los estudios en animales como se ha demostrado no ser suficientemente seguro para el uso en seres humanos9. Por lo tanto, deben simplificarse los procedimientos quirúrgicos y reducir el riesgo de lesiones para traducir intralabyrinthine enfoques en la clínica.
Varios enfoques intralabyrinthine han sido evaluados en animales por inyección a través de la RWM5,10,11 y en la scala media12,13,14, tympani del scala 15 , 16la scala portal17, los canales semicirculares16,18,19,20y el saco endolinfático21. Cada uno de estos enfoques tiene ventajas y desventajas6. A través de la RWM es atraumática en ratones neonatales5,22. Sin embargo, se observa una pérdida de audición leve en ratones adultos después a RWM inyección23, posiblemente debido a la efusión del oído medio después de la cirugía24. Inyección de medios de Scala, que consiste en la inyección del reactivo directamente en el espacio endolinfático que contiene el epitelio sensorial, alcanza una concentración de reactivo alta en destino final-órganos12,14, 25 , 26. sin embargo, este enfoque requiere un procedimiento complejo y da lugar a elevación significativa del umbral de audición si se realiza más adelante que día postnatal 5 (P5)25,27, que limita su aplicación.
En comparación con los mencionados enfoques intralabyrinthine, canalostomy causa un mínimo daño al oído interno, especialmente en ratones adultos16,18,28,29,30, que es importante para la evaluación de los efectos protectores y aspectos de translational. Además, en los roedores, los canales semicirculares están situados más allá de la bulla, que facilita los procedimientos quirúrgicos y evita perturbaciones del oído medio durante la cirugía. En la clínica, cirugías de canal semicircular se utilizan para el Vértigo posicional paroxístico benigno intratable31,32,33, lo que sugiere la viabilidad clínica de canalostomy. Desde que primero fue descrita por Kawamoto et al. 16 en 2001, canalostomy se ha utilizado para entregar diversos reactivos, tales como vectores virales, siRNA, células madre y aminoglucósidos, en el oído interno murino18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inoculación de vectores de virus adeno-asociado (AAV) por canalostomy que la sobreexpresión de genes exógenos en el epitelio sensorial y las neuronas primarias de la cóclea y final-órganos vestibulares18,28, 29,30. Whirlin terapia génica por canalostomy restaura la función de equilibrio y mejora la audición en un modelo murino de humano Usher síndrome19, lo que sugiere que canalostomy es útil para estudios de terapia génica para enfermedades genéticas cochleovestibular. Trasplante de células madre mesenquimales por canalostomy resulta en la reorganización de fibrocitos coclear y la recuperación de la audición en un modelo de rata de pérdida de oído sensorineural aguda35. Además, canalostomy puede utilizarse para introducir aminoglucósidos en el oído interno para establecer las lesiones vestibulares18,34,38, y las inyecciones múltiples se pueden realizar si es necesario18 , 34.
En el presente artículo, se describen, en detalle, técnicas de canalostomy en ratones adultos y neonatales. Nos inocula diversos reactivos, colorante verde rápido como serotipo AAV 8 (AAV8), junto con el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) (AAV8-GFP) y la estreptomicina, en el oído interno de ratón para evaluar los resultados inmediatos y a largo plazo después de canalostomy.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, mostramos que fármaco de canalostomy dio lugar a la amplia difusión del reactivo a lo largo de la cóclea y final-órganos vestibulares. Como un método de entrega del gene de oído interno, canalostomy dio lugar a la expresión de GFP en el oído interno de ratones adultos y neonatales con mínimo daño a la función auditiva y vestibular. Además, las inyecciones múltiples pueden realizarse fácilmente en el mismo animal.
Una de las mayores fortalezas de canalostomy es qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (números de concesión 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
References
- Stachler, R. J., et al. Clinical practice guideline: sudden hearing loss. Otolaryngol Head Neck Surg. 146 (3 Suppl), S1-S35 (2012).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19 (3), 345-350 (2013).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), e52187 (2015).
- Ahmed, H., Shubina-Oleinik, O., Holt, J. R. Emerging Gene Therapies for Genetic Hearing Loss. J Assoc Res Otolaryngol. 18 (5), 649-670 (2017).
- Murillo-Cuesta, S., et al. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J Vis Exp. (121), e54951 (2017).
- Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J Vis Exp. (105), e53131 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Principles of local drug delivery to the inner ear. Audiol Neurootol. 14 (6), 350-360 (2009).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35 (3), 264-272 (2017).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Chang, Q., et al. Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome. EMBO Mol Med. 7 (8), 1077-1086 (2015).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. J Neurosci Methods. 150 (1), 67-73 (2006).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Bowers, W. J., et al. Neurotrophin-3 transduction attenuates cisplatin spiral ganglion neuron ototoxicity in the cochlea. Mol Ther. 6 (1), 12-18 (2002).
- Wang, G. P., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer targeting normal and traumatized mouse utricle. Gene Ther. 21 (11), 958-966 (2014).
- Isgrig, K., et al. Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25 (3), 780-791 (2017).
- Gassner, D., Durham, D., Pfannenstiel, S. C., Brough, D. E., Staecker, H. Canalostomy as a surgical approach for cochlear gene therapy in the rat. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1830-1836 (2012).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene transfection in neonatal mice using adeno-associated viral vector: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Chien, W. W., McDougald, D. S., Roy, S., Fitzgerald, T. S., Cunningham, L. L. Cochlear gene transfer mediated by adeno-associated virus: Comparison of two surgical approaches. Laryngoscope. 125 (11), 2557-2564 (2015).
- Zhu, B. Z., Saleh, J., Isgrig, K. T., Cunningham, L. L., Chien, W. W. Hearing Loss after Round Window Surgery in Mice Is due to Middle Ear Effusion. Audiol Neurootol. 21 (6), 356-364 (2017).
- Wang, Y., et al. Early postnatal virus inoculation into the scala media achieved extensive expression of exogenous green fluorescent protein in the inner ear and preserved auditory brainstem response thresholds. J Gene Med. 15 (3-4), 123-133 (2013).
- Lee, M. Y., et al. Survival of human embryonic stem cells implanted in the guinea pig auditory epithelium. Sci Rep. 7, 46058 (2017).
- Ishimoto, S., Kawamoto, K., Kanzaki, S., Raphael, Y. Gene transfer into supporting cells of the organ of Corti. Hear Res. 173 (1-2), 187-197 (2002).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33 (4), 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524 (2017).
- Guo, J. Y., et al. Cochleovestibular gene transfer in neonatal mice by canalostomy. Neuroreport. 28 (11), 682-688 (2017).
- Beyea, J. A., Agrawal, S. K., Parnes, L. S. Transmastoid semicircular canal occlusion: a safe and highly effective treatment for benign paroxysmal positional vertigo and superior canal dehiscence. Laryngoscope. 122 (8), 1862-1866 (2012).
- Naples, J. G., Eisen, M. D. The History and Evolution of Surgery on the Vestibular Labyrinth. Otolaryngol Head Neck Surg. 155 (5), 816-819 (2016).
- Hamilton, L., Keh, S., Spielmann, P. M., Hussain, S. S. How we do it: locating the posterior semicircular canal in occlusion surgery for refractory benign paroxysmal positional vertigo: a cadaveric temporal bone study. Clinical Otolaryngology. 41 (2), 190-193 (2016).
- Jung, J. Y., et al. siRNA targeting Hes5 augments hair cell regeneration in aminoglycoside-damaged mouse utricle. Mol Ther. 21 (4), 834-841 (2013).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. Am J Pathol. 171 (1), 214-226 (2007).
- Pfannenstiel, S. C., Praetorius, M., Plinkert, P. K., Brough, D. E., Staecker, H. Bcl-2 gene therapy prevents aminoglycoside-induced degeneration of auditory and vestibular hair cells. Audiol Neurootol. 14 (4), 254-266 (2009).
- Kawamoto, K., Izumikawa, M., Beyer, L. A., Atkin, G. M., Raphael, Y. Spontaneous hair cell regeneration in the mouse utricle following gentamicin ototoxicity. Hear Res. 247 (1), 17-26 (2009).
- Wang, G. P., et al. Notch signaling and Atoh1 expression during hair cell regeneration in the mouse utricle. Hear Res. 267 (1-2), 61-70 (2010).
- Pietola, L., et al. HOX-GFP and WOX-GFP lentivirus vectors for inner ear gene transfer. Acta Otolaryngol. 128 (6), 613-620 (2008).
- Han, J. J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
