Canalostomy como uma abordagem cirúrgica para entrega de drogas para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatal
Summary
Aqui descrevemos o procedimento canalostomy, que permite a entrega de drogas local para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais através do canal semicircular com danos mínimos para a função auditiva e vestibular. Esse método pode ser usado para inocular vetores virais, fármacos e moléculas pequenas para o ouvido interno do rato.
Abstract
Entrega local de drogas terapêuticas para o ouvido interno é uma terapia promissora para as doenças do ouvido interno. Injeção por meio de canais semicirculares (canalostomy) tem demonstrada ser uma abordagem útil para entrega de drogas para o ouvido interno. O objetivo deste artigo é descrever, detalhadamente, as técnicas cirúrgicas envolvidas no canalostomy em camundongos adultos e Neonatais. Como indicado pelo corante verde-rápido e vírus adeno-associado serótipo 8 com o gene da proteína verde fluorescente, o canalostomy facilitou a ampla distribuição dos reagentes injetados na cóclea e vestibulares final-órgãos com o mínimo de danos à audição e função vestibular. A cirurgia foi implementada com sucesso em camundongos adultos e Neonatais; na verdade, múltiplas cirurgias podem ser feitas se necessário. Em conclusão, a canalostomy é uma abordagem eficaz e segura para a entrega da droga para o ouvido interno de ratos adultos e Neonatais e pode ser usado para tratar doenças da orelha interna humana no futuro.
Introduction
Neurossensorial de audição, perda e afetam disfunção vestibular um número substancial de pacientes e estão intimamente associados com transtornos do ouvido interno. Entrega de drogas terapêuticas para o ouvido interno mostra a promessa para o tratamento de distúrbios do ouvido interno. Uma abordagem sistêmica ou local pode ser usada para entregar drogas para o ouvido interno. Algumas doenças do ouvido interno são tratadas com sucesso com administração de drogas sistêmicas, tais como perda de audição súbita idiopática, que é geralmente tratada com esteroides sistêmicos1. Além disso, Lentz et al mostrou que a administração sistémica do oligonucleotide antisentido foi capaz de melhorar a audição e equilibrar as funções no modelo do rato mutante Ush1c2. No entanto, grande parte das doenças do ouvido interno não são efetivamente tratados pela administração de drogas sistêmicas por causa da barreira sangue-labirinto, o que limita o acesso de drogas para o ouvido interno3,4. Em contraste, estratégias de entrega de droga local podem tratar distúrbios de ouvido interno com mais eficiência. Com efeito, o ouvido interno é potencialmente um alvo ideal para a entrega da droga local; está cheio de líquido, que facilita a disseminação da droga após a difusão de um site ou injeção, e é relativamente isolado de órgãos vizinhos, que limita os efeitos colaterais de5,6.
Estratégias de entrega de droga local incluem intratimpânica e intralabyrinthine métodos. A eficácia da via intratimpânica baseia-se em grande parte na permeabilidade da droga através da membrana da janela redonda (RWM) e o tempo de permanência da droga no RWM3,4,7,8. Assim, não é apropriado para a entrega de drogas ou reagentes que não podem penetrar a RWM. Intralabyrinthine métodos envolvem a inoculação de drogas diretamente para o ouvido interno, resultando em uma dose alta e ampla distribuição. No entanto, intralabyrinthine métodos requerem cirurgias delicadas e são invasivos, levando a danos à função do ouvido interno. Atualmente, a injeção intralabyrinthine de drogas é usada apenas em estudos com animais, como não tem sido demonstrado ser suficientemente seguro para uso em seres humanos9. Portanto, os procedimentos cirúrgicos devem ser simplificados e reduzir o risco de lesão para traduzir intralabyrinthine abordagens para a clínica.
Várias abordagens intralabyrinthine foram avaliadas em animais por injeção através a RWM5,10,11 e no scala mídia12,13,14, a scala tympani 15 , 16, o scala vestíbulo17, os canais semicirculares16,18,19,20e o saco endolinfático21. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens6. Entrega através do RWM é atraumática em ratos neonatal5,22. No entanto, uma perda auditiva leve é observada em ratos adultos após injeção RWM23, possivelmente devido à efusão do ouvido médio após a cirurgia,24. Injeção de mídia Scala, que envolve a injeção do reagente diretamente para o espaço endolinfático que contém o epitélio sensorial, alcança uma concentração alta de reagente no destino final-órgãos12,14, 25 , 26. no entanto, essa abordagem requer um procedimento complexo e resulta em significativa elevação do limiar da audição, se realizada, o mais tardar dia pós-natal 5 (P5)25,27, que limita a sua aplicação.
Em comparação com as abordagens intralabyrinthine acima mencionadas, canalostomy provoca danos mínimos para o ouvido interno, especialmente em ratos adultos16,18,28,29,,30, que é importante para a avaliação dos efeitos protetores e aspectos translacionais. Além disso, em roedores, os canais semicirculares estão localizados além o bulla, que facilita os procedimentos cirúrgicos e evita perturbações do ouvido médio durante a cirurgia. Na clínica, canal semicircular cirurgias são utilizadas para vertigem posicional paroxística benigna intratável31,32,33, sugerindo a viabilidade clínica de canalostomy. Desde que foi primeiramente descrito por Kawamoto et al. 16 em 2001, canalostomy tem sido usado para entregar vários reagentes, tais como vetores virais, siRNA, células-tronco e aminoglicosídeos, em murino ouvido interno18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inoculação de vetores de vírus adeno-associado (AAV) por canalostomy habilitar a superexpressão de genes exógenos no epitélio sensorial e neurônios primários da cóclea e extremidade-órgãos vestibular18,28, 29,30. Whirlin terapia genética pelo canalostomy função de equilíbrio e melhora a audição em um modelo do rato do humano Usher síndrome19, sugerindo que canalostomy é útil para estudos de terapia gênica para doenças genéticas cochleovestibular. Transplante de células-tronco mesenquimais por canalostomy resulta na reorganização de fi coclear e recuperação de audiência em um modelo do rato de perda de audição neurossensorial aguda35. Além disso, canalostomy pode ser usado para introduzir os aminoglicosídeos no ouvido interno estabelecer lesões vestibulares18,34,38, e múltiplas injeções podem ser realizadas se necessário18 , 34.
No presente artigo, descrevemos, em detalhe, as técnicas de canalostomy em camundongos adultos e Neonatais. Nós inoculado vários reagentes, incluindo tintura verde-rápido e sorotipo AAV 8 (AAV8), juntamente com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) (AAV8-GFP) e estreptomicina, no ouvido interno para avaliar os resultados imediatos e a longo prazo após a canalostomy do mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, mostramos que administração de medicamentos por canalostomy resultou em ampla distribuição do reagente ao longo da cóclea e extremidade-órgãos vestibulares. Como um método de entrega de gene do ouvido interno, canalostomy resultou na expressão de GFP no ouvido interno de ratos adultos e Neonatais com danos mínimos para função auditiva e vestibular. Além disso, injeções múltiplas podem ser facilmente executadas no mesmo animal.
Uma das maiores forças de canalostom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (concessão números 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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