Canalostomy come un approccio chirurgico alla consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati
Summary
Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell’orecchio interno del mouse.
Abstract
Recapito locale di farmaci terapeutici nell’orecchio interno è una promettente terapia per patologie dell’orecchio interno. Iniezione tramite canali semicircolari (canalostomy) ha dimostrato di essere un utile approccio alla consegna di droga locale nell’orecchio interno. L’obiettivo di questo articolo è di descrivere, in dettaglio, le tecniche chirurgiche coinvolte nella canalostomy in topi sia in adulti e neonatali. Come indicato dal colorante fast-verde e virus adeno-associato sierotipo 8 con il gene della proteina fluorescente verde, il canalostomy facilitato ampia distribuzione di reagenti iniettati nella coclea e fine-organi vestibolari con minimi danni all’udito e funzione vestibolare. L’ambulatorio è stato implementato con successo nei topi sia in adulti e neonatali; Infatti, gli ambulatori multipli possono essere eseguiti se necessario. In conclusione, canalostomy è un approccio efficace e sicuro alla consegna della droga nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati e può essere usato per trattare patologie dell’orecchio interno umano in futuro.
Introduction
Neurosensoriale dell’udito perdita e la disfunzione vestibolare influiscono un numero considerevole di pazienti e sono strettamente associata a disturbi dell’orecchio interno. Consegna di farmaci terapeutici nell’orecchio interno Mostra la promessa per il trattamento di patologie dell’orecchio interno. Un approccio sistemico o locale può essere utilizzato per consegnare i farmaci nell’orecchio interno. Alcune malattie dell’orecchio interno sono trattati con successo con farmaci sistemici, come la perdita dell’udito improvvisa idiopatica, che è comunemente trattato con steroidi sistemici1. Inoltre, Lentz et al hanno dimostrato che la somministrazione sistemica di oligonucleotide antisenso è stato in grado di migliorare l’udito e l’equilibrio di funzioni in Ush1c topo mutante modello2. Tuttavia, gran parte delle patologie dell’orecchio interno in modo efficace non sono trattati da somministrazione sistemica a causa della barriera sangue-labirinto, che limita l’accesso di droga per l’orecchio interno3,4. Al contrario, strategie di consegna della droga locale possono trattare patologie dell’orecchio interno in modo più efficiente. Infatti, l’orecchio interno è potenzialmente un bersaglio ideale per la consegna di droga locale; è pieno di liquido, che facilita la diffusione della droga dopo uno-sito diffusione o iniezione, ed è relativamente isolato da organi vicini, che limita gli effetti collaterali5,6.
Strategie di consegna di droga locali includono metodi intratimpanici e intralabyrinthine. L’efficacia del percorso intratimpanico si basa in gran parte sulla permeabilità del farmaco attraverso la membrana della finestra rotonda (RWM) e il tempo di permanenza del farmaco sul RWM3,4,7,8. Così, non è adatto per la consegna di farmaci o reagenti che non possono penetrare il RWM. Intralabyrinthine metodi implicano l’inoculazione di farmaci direttamente nell’orecchio interno, con conseguente una dose elevata e distribuzione capillare. Tuttavia, intralabyrinthine metodi richiedono interventi chirurgici delicati e sono invasivi, conseguenti danni alla funzione dell’orecchio interno. Attualmente, la intralabyrinthine iniezione delle droghe viene utilizzata solo negli studi sugli animali come non è stato dimostrato di essere sufficientemente sicuro per uso in esseri umani9. Di conseguenza, le procedure chirurgiche devono essere semplificate e ridurre il rischio di lesioni per tradurre intralabyrinthine approcci in clinica.
Intralabyrinthine diversi approcci sono stati valutati negli animali tramite l’iniezione attraverso il RWM5,10,11 e nella scala media12,13,14, tympani di scala 15 , 16, il vestibolo di scala17, i canali semicircolari16,18,19,20e il sacco endolinfatico21. Ciascuno di questi approcci ha vantaggi e svantaggi6. Consegna attraverso il RWM è atraumatica in topi neonatali5,22. Tuttavia, una perdita della capacità uditiva delicata viene osservata in topi adulti dopo iniezione RWM23, probabilmente a causa di effusione dell’orecchio centrale dopo la chirurgia24. Iniezione del mezzo di scala, che comprende l’iniezione di reagente direttamente nello spazio endolinfatico contenente l’epitelio sensoriale, raggiunge una concentrazione di reagente alta nella destinazione finale-organi12,14, 25 , 26. Tuttavia, questo approccio richiede una procedura complessa e risultati in significativa elevazione della soglia dell’udito se eseguita più tardi postnatale giorno 5 (P5)25,27, che limita la sua applicazione.
Rispetto ai suddetti approcci intralabyrinthine, canalostomy provoca il minimo danno all’orecchio interno, soprattutto in topi adulti16,18,28,29,30, che è importante per la valutazione degli effetti protettivi e aspetti traslazionali. Inoltre, nei roditori, i canali semicircolari si trovano oltre la bulla, che facilita le procedure chirurgiche ed evita la dispersione dell’orecchio medio durante la chirurgia. Nella clinica, canale semicircolare ambulatori sono utilizzati per vertigine posizionale parossistica benigna intrattabile31,32,33, suggerendo la fattibilità clinica di canalostomy. Poiché in primo luogo è stato descritto da Kawamoto et al. 16 nel 2001, canalostomy è stato utilizzato per trasportare vari reagenti, quali vettori virali, siRNA, cellule staminali e aminoglicoside, nel murino dell’orecchio interno18,19,28,29 ,34,35,36,37. Inoculazione di vettori di virus adeno-associato (AAV) di canalostomy attivare la sovraespressione di geni esogeni in epitelio sensoriale e neuroni primari della coclea e del fine-organi vestibolari18,28, 29,30. Whirlin terapia genica di canalostomy ristabilisce la funzione di equilibrio e migliora l’ascolto in un modello murino di umano Usher sindrome19, suggerendo che canalostomy è utile per gli studi di terapia genica per le malattie genetiche cochleovestibular. Trapianto di cellule staminali mesenchimali da canalostomy risultati nella riorganizzazione dei fibrociti cocleari e recupero dell’udito in un modello del ratto di di perdita dell’udito neurosensoriale acuta35. Inoltre, canalostomy può essere usato per introdurre gli aminoglicosidi nell’orecchio interno per stabilire lesioni vestibolari18,34,38, e iniezioni multiple possono essere eseguite se necessario18 , 34.
Nel presente articolo, descriveremo nel dettaglio, tecniche di canalostomy in topi adulti e neonati. Abbiamo inoculato reagenti vari, tra cui fast-verde colorante e sierotipo AAV 8 (AAV8), insieme con il gene della proteina fluorescente verde (GFP) (AAV8-GFP) e streptomicina, nell’orecchio interno del mouse per valutare i risultati immediati e a lungo termine dopo canalostomy.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato che la consegna della droga di canalostomy provocato distribuzione capillare del reagente in tutta la coclea e fine-organi vestibolari. Come un metodo di consegna del gene dell’orecchio interno, canalostomy provocato l’espressione di GFP nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati con danni minimi alla funzione uditiva e vestibolare. Inoltre, le iniezioni multiple possono essere facilmente eseguite nello stesso animale.
Uno dei maggiori punti di forza …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (sovvenzione numeri 81570912, 81771016, 81100717).
Materials
| Polymide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/1 | |
| 10μl Microsyringe | Hamilton Company | 80001 | |
| Xylazine HCL | Sigma-Aldrich Co. Llc. | X-1251 | |
| Operating Miroscope | Carl Zeiss Optical LLC. | Pico | |
| Micro Forceps | Dumont Dumostar | 10576 | |
| Fast-green Dye | Sigma-Aldrich Co. Llc. | F7252 | |
| AAV8-GFP | BioMiao Biological Technology Co. Ltd (Beijing, China) | 20161101 | Titer: 2×10e12 vg/mL |
| Streptomycin Sulfate | Sigma-Aldrich Co. Llc. | S9137 | |
| Microinjection Pump | Stoelting Co. | 789100S | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| 1 cc Syringe | Mishawa Medical Industries Ltd. (Shanghai, China) | 2011-3151258 | |
| Ketamine HCL | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd. (Fujian, China) | H35020148 | |
| Electric Animal Clipper | Codos Electrical Appliances Co., Ltd. (Guangdong, China) | CP-8000 | |
| Cotton Pellet | Yatai Healthcare Ltd. (Henan, China) | Yu-2008-1640081 | |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. (Shanghai, China) | Hu-2013-2650207 | |
| Eye Ointment | Beijing Shuangji Pharmaceutical Ltd. (Beijng China) | H11021270 |
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