Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en kamp dynamiek met behulp van een ex vivo Langendorff setup.
Sinds de uitvinding in de late 19e eeuw, de Langendorff ex vivo hart perfusie systeem is nog steeds een relevant instrument voor de studie van een breed spectrum van fysiologische, biochemische, morfologische en farmacologische parameters in Centraal denervated harten. Hier beschrijven we een setup voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) dynamiek. Het intracardiac autonome zenuwstelsel wordt gemoduleerd door de mechanische dissectie van atriale vet pads-in welke lymfkliertest ganglia zich voornamelijk bevinden — of door het gebruik van globale evenals gerichte farmacologische interventies. Een octapolar elektrofysiologische katheter wordt binnengebracht in de juiste atrium en het ventrikel rechts en epicardial geplaatste multi elektrode arrays (MEA) voor hoge resolutie toewijzing worden gebruikt om te bepalen van de cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis. Förster resonance energy transfer (FRET) imaging wordt uitgevoerd voor de real-time controle van cAMP in verschillende cardiale gebieden. Neuromorphology wordt bestudeerd door middel van antilichaam gebaseerde kleuring van hele hart met behulp van neuronale markeringen om de identificatie en de modulatie van de specifieke doelstellingen van het intracardiac autonome zenuwstelsel in de uitgevoerde studies te leiden. De ex vivo Langendorff setup zorgt voor een groot aantal reproduceerbare experimenten in een korte tijd. Echter het deels open karakter van de instellingen (bv., tijdens de MEA metingen) constante temperatuurcontrole bemoeilijkt en moet tot een minimum worden beperkt. Deze beschreven methode maakt het mogelijk om te analyseren en het moduleren van het intracardiac autonome zenuwstelsel in gedecentraliseerde harten.
Het Langendorff ex vivo hart perfusie systeem is nog steeds een relevant instrument voor het uitvoeren van een breed spectrum van morfologische, fysiologische, biochemische en farmacologische studies in Centraal denervated harten1,2 ,3,4,5 sinds de uitvinding in de late 19th eeuw6. Dit systeem wordt tot op heden nog steeds veel gebruikt voor verschillende onderwerpen (bijv., ischemie-reperfusie) of om te studeren cardiale farmacologische effecten7,8, en is een basisinstrument in cardiovasculair onderzoek. De levensduur van deze methode resultaten van verschillende voordelen (bv., metingen zijn uitgevoerd zonder de invloed van het centrale zenuwstelsel of andere organen, systemische circulatie of circulerende hormonen). Indien nodig, kunnen geneesmiddelen worden toegevoegd op een gecontroleerde manier aan de perfusie-buffer of rechtstreeks toegepast op specifieke structuren. Experimenten zijn reproduceerbaar, en een relatief hoog aantal experimenten kan worden uitgevoerd in een korte periode van tijd. Het (gedeeltelijk) open karakter van de instelling kan temperatuurregeling moeilijk en moet rekening worden gehouden. Hoewel de Langendorff systeem ook in de grotere soorten9 gebruikt wordt, kleinere dieren worden voornamelijk gebruikt als de experimentele opzet minder complex en een grotere biologische variabiliteit is (bv., transgene muis modellen) kan worden gebruikt.
In de experimentele opzet van dit protocol is de invloed van het intracardiac autonome zenuwstelsel op elektrofysiologische basisparameters, ventriculaire arrhythmogenesis epicardial geleiding en cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) dynamiek geëvalueerd. Een groot aantal intracardiac ganglia, die zijn voornamelijk gevestigd in de atriale vet pads en zijn nu goed bekend bij de controle van de cardiale electrofysiologie onafhankelijk van centrale neuraal controle, zijn dat ofwel links intact of handmatig verwijderd met zorgvuldige mechanische dissectie. Een farmacologische modulatie van het autonome zenuwstelsel wordt wereldwijd door farmaceutische producten toe te voegen aan de perfusie buffer of lokaal door gerichte modulatie van de atriale ganglia uitgevoerd. Na de experimenten zijn de harten geschikt voor eenbeoordeling van de immunohistological als alle cellen van het bloed zijn verwijderd als gevolg van de continue perfusie, die de kwaliteit van de kleuring verhogen kan.
Het algemene doel van de beschreven technieken wil bieden nieuwe perspectieven voor gedetailleerde studies over het effect van het autonome zenuwstelsel op cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis in het hart van de muis. Een reden om deze techniek te gebruiken is dat het mogelijk is te bestuderen en te veranderen van het autonome zenuwstelsel zonder de invloed van het centrale zenuwstelsel. Een groot voordeel is de gemakkelijke tewerkstelling van farmacologische experimenten, in welke potentiële pro- of antiarrhythmic eigenschappen van oude en nieuwe agenten kunnen worden getest. Daarnaast zijn transgene en knockoutstadia Muismodellen van verschillende hartziekten beschikbaar voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan hartritmestoornissen, hartfalen of metabole ziekten. Deze aanpak heeft ons begrip van hoe het autonome zenuwstelsel op atriale niveau invloed op ventriculaire cardiale electrofysiologie als het doen ontstaan van hartritmestoornissen hebben kan verbeterd.
In dit manuscript, wordt de bekende Langendorff ex vivo hart perfusie systeem gepresenteerd als een hulpmiddel om te bestuderen van de impact van intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en arrhythmogenesis met behulp van verschillende mapping en stimulatie technieken met inbegrip van endocardial en epicardial benaderingen.
Verschillende onderdelen van het protocol zijn cruciaal voor de installatie. Ten eerste is het belangrijk om een voorbereiding techniek waarin de atrial…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Hartwig Wieboldt voor zijn uitstekende technische bijstand, en de UKE microscopie Imaging faciliteit (Umif) van de Universiteit medisch centrum Hamburg-Eppendorf voor het verstrekken van microscopen en ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. en door de DZHK (Duitse centrum voor cardiovasculair onderzoek) [FKZ 81Z4710141].
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET |