Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und Lager Dynamik mit einem ex-Vivo Langendorff Setup.
Abstract
Seit seiner Erfindung imspäten 19 Jahrhundert weiter Langendorff ex Vivo Herz-Perfusions-System zu einem wichtigen Instrument für das Studium eines breiten Spektrums an physiologische, biochemische, morphologische und pharmakologischen Parameter in Zentral denervierten Herzen. Hier beschreiben wir eine Setup für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Dynamik. Die intrakardiale vegetative Nervensystem moduliert durch die mechanische Zerlegung von Vorhofflimmern Fett Pads-in welche murinen Ganglien sich hauptsächlich befinden — oder durch die Nutzung des globalen sowie gezielte pharmakologische Interventionen. Ein Octapolar elektrophysiologische Katheter wird in den rechten Vorhof und der rechten Herzkammer eingeführt, und epicardial platziert Multi-Elektroden (MEA) für hochauflösende Abbildung dienen, kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis zu bestimmen. Förster Resonanz Energietransfer (FRET) imaging wird für die Echtzeit-Überwachung von cAMP Ebenen in verschiedenen kardialen Regionen durchgeführt. Neuromorphology wird untersucht mittels Antikörper-basierten Färbung von ganzem Herzen mit neuronalen Marker, um die Identifikation und Modulation der spezifischen Ziele des intrakardialen Nervensystem in den durchgeführten Studien zu führen. Das ex-Vivo Langendorff Setup ermöglicht eine hohe Anzahl von reproduzierbare Experimente in kurzer Zeit. Dennoch, der teilweise offene Charakter des Setups (zB., während MEA Messungen) Konstante Temperaturregelung erschwert und sollte auf ein Minimum gehalten werden. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, zu analysieren und zu modulieren die intrakardiale vegetative Nervensystem in dezentralen Herzen.
Introduction
Langendorff ex Vivo Herz Perfusion System weiter zu einem wichtigen Instrument für die Durchführung eines breiten Spektrums an morphologische, physiologische, Biochemische und pharmakologische Studien in Zentral denervierten Herzen1,2 ,3,4,5 seit ihrer Erfindung in den späten 19th Jahrhundert6. Bis heute ist dieses System noch weit verbreitet zu verschiedenen Themen (zB., Ischämie Reperfusion) oder zum Studium Herz-pharmakologische Effekte7,8, und ist ein grundlegendes Instrument in der Herz-Kreislauf-Forschung. Die Langlebigkeit dieser Methode ergibt sich aus mehrere Vorteile (zB., Messungen ohne den Einfluss des zentralen Nervensystems oder anderer Organe, systemischen Kreislauf oder zirkulierenden Hormone). Bei Bedarf können Arzneimittel kontrolliert Perfusion Puffer hinzugefügt oder direkt an bestimmte Strukturen angewendet werden. Experimente sind reproduzierbar und eine relativ hohe Anzahl von Experimenten kann in kurzer Zeit durchgeführt werden. Die (teilweise) offene Natur des Setups machen Temperaturregulierung schwierig und muss berücksichtigt werden. Obwohl das Langendorff-System auch in größeren Arten9verwendet wird, kleinere Tiere dienen in erster Linie als der experimentelle Aufbau weniger komplex und eine größere biologische Variabilität ist (zB., transgenen Maus Modelle) verwendet werden.
In der Versuchsanordnung dieses Protokolls ist der Einfluss des intrakardialen Nervensystem auf elektrophysiologische Grundparameter, ventrikuläre Arrhythmogenesis, epicardial Wärmeleitung und zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Dynamik ausgewertet. Eine große Anzahl von intrakardialen Ganglien, die befinden sich hauptsächlich in der atrial Fettpolster und sind nun bekannt, kardiale Elektrophysiologie unabhängig von zentralen neuronalen Kontrolle zu kontrollieren, sind entweder intakt oder manuell entfernt mit sorgfältigen mechanischen Links Dissektion. Eine pharmakologische Modulation des autonomen Nervensystems wird weltweit durch Zugabe von Arzneimitteln auf den Puffer, Perfusion oder lokal durch gezielte Modulation von Vorhofflimmern Ganglien durchgeführt. Nach den Experimenten sind die Herzen gut geeignet für eine immunohistologische Bewertung, wie alle Blutzellen durch die kontinuierliche Perfusion entfernt worden sind, die wodurch die Qualität der Färbung erhöht werden kann.
Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Techniken ist es, neuartige Perspektiven für detaillierte Studien über die Auswirkungen des autonomen Nervensystems auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis im Herzen Maus bieten. Ein Grund für die Verwendung dieser Technik ist, dass es möglich ist, zu studieren und das vegetative Nervensystem ohne Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem zu ändern. Ein großer Vorteil ist die einfache Beschäftigung pharmakologische Experimente, in welche möglichen pro- oder antiarrhythmische Eigenschaften des alten und neuen Agenten können getestet werden. Darüber hinaus stehen transgenen und Knockout Maus-Modellen der verschiedenen Herzerkrankungen untersuchen die Mechanismen, Herzrhythmusstörungen, Herzinsuffizienz oder Stoffwechselerkrankungen. Dieser Ansatz wurde erweitert unser Verständnis der Auswirkungen des autonomen Nervensystems auf das Vorhofflimmern Niveau auf ventrikulären kardialen Elektrophysiologie und die Induktion von Arrhythmien.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript ist das bekannte Langendorff ex Vivo Herz Perfusion System als Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis mit unterschiedlichen Mapping und stimulationstechniken vorgestellt. einschließlich endokardialen und epicardial Ansätze.
Mehrere Teile des Protokolls sind entscheidend für das Setup. Erstens ist es wichtig, eine Vorbereitung Technik zu verwenden, in der das Vorhofflimmern Fe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Hartwig Wieboldt für seine hervorragenden technischen Betreuung und dem UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) der des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf für die Mikroskope und Unterstützung zu danken. Diese Forschung wurde finanzierte Bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. und durch das DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
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